羅時(shí)珂，周序鋒，謝東明

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，江西贛州 341000)

阿利吉侖對(duì)心力衰竭代謝重構(gòu)的影響

羅時(shí)珂，周序鋒△，謝東明

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，江西贛州 341000)

目的 探討直接腎素抑制劑阿利吉侖(AL)對(duì)心力衰竭大鼠心肌代謝重構(gòu)的影響。方法 健康純系雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為4組，每組10只，即對(duì)照組、異丙腎上腺素(ISO)組(采用腹腔內(nèi)注射ISO復(fù)制慢性心力衰竭的動(dòng)物模型)、貝那普利(BH)組(在給予BH的基礎(chǔ)上建立ISO復(fù)制慢性心力衰竭的動(dòng)物模型)和AL組(在給予AL的基礎(chǔ)上建立ISO復(fù)制慢性心力衰竭的動(dòng)物模型),干預(yù)時(shí)間4周。心臟超聲檢測(cè)檢測(cè)各腔大小及心功能，HE染色光鏡下觀察大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)臟器指數(shù)變化，測(cè)定各組大鼠血漿腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平，Western blot法測(cè)定大鼠心肌組織中金屬蛋白酶(MMPs)、金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)的蛋白表達(dá)水平，測(cè)定MMPs/TIMPs比值。結(jié)果 與ISO組及BH組相比AL組大鼠心肌病理形態(tài)、左室大小、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)明顯改善，PRA、AngⅡ水平及MMPs/TIMPs比值均降低(P<0．01)。結(jié)論 在慢性心力衰竭的進(jìn)展過(guò)程中阿利吉侖由于能降低PRA，對(duì)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的阻斷作用更充分在改善心功能、抑制心室重構(gòu)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

心力衰竭；金屬蛋白酶類(lèi)；阿利吉侖；腎素活性

近年來(lái)研究證實(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，抑制RAAS系統(tǒng)的激活是治療心力衰竭的重要途徑，現(xiàn)階段的藥物治療主要以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)類(lèi)藥物來(lái)阻斷RAAS系統(tǒng)從而達(dá)到改善心功能、抑制心室重構(gòu)的目的[1-2],延緩心力衰竭的進(jìn)程,但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ACEI、ARB均不能完全阻斷RAAS系統(tǒng)，腎素作為RAAS系統(tǒng)的起始步驟，可通過(guò)直接抑制其活性而阻斷RAAS系統(tǒng)，研究表明腎素活性(PRA)可損害心腦血管系統(tǒng)[3]，而阿利吉侖(Aliskiren,AL)作為直接腎素抑制劑從源頭抑制腎素對(duì)RAAS系統(tǒng)的阻斷更完全[4]，本實(shí)驗(yàn)就阿利吉侖在改善心力衰竭的代謝重構(gòu)上做進(jìn)一步的探討。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質(zhì)量150～200 g，贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，分為4組，每組10只，即對(duì)照組、異丙腎上腺素(ISO)(ISO組)、貝那普利(BH，BH組)和AL組。

1.2 主要藥物及試劑 AL為瑞士諾華公司產(chǎn)品；BH為瑞士諾華公司產(chǎn)品；ISO為上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品；血漿血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)、AngⅡ放射免疫分析盒為北京福瑞生物工程公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠一抗金屬蛋白酶(MMPs)、金屬蛋白酶抑制因子(TIMP)由Santa Cruz公司提供；二抗(生物素化羊抗兔IgG)由北京中衫金橋生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 BH組給予含BH的混懸液灌胃，給藥量5 mg·kg-1·d-1，同時(shí)腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)連續(xù)30 d，AL組給予含AL的混懸液灌胃，給藥量50 mg·kg-1·d-1，同時(shí)腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)連續(xù)30 d，對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃連續(xù)30 d，ISO組腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)連續(xù)30 d。

1.3.2 心臟超聲檢查 大鼠以0.3%戊巴比妥鈉溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后備皮，應(yīng)用超聲心動(dòng)儀(西門(mén)子ACUSON Sequoia512)及5-12 MHz高頻線控探頭(西門(mén)子公司)進(jìn)行超聲檢測(cè),檢測(cè)左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)。

1.3.3 心肌組織病理學(xué)檢查 取大鼠左心室心尖部心肌，4%甲醛固定后常規(guī)切片，HE染色以備光鏡下觀察；2.5%戊二醛固定后電鏡下觀察。

1.3.4 大鼠心臟指數(shù)測(cè)定 用預(yù)冷的生理鹽水洗去心臟殘留血液，剪去周?chē)Y(jié)締組織和血管，濾紙吸干水分稱量心臟濕質(zhì)量。心臟指數(shù)=心臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.5 大鼠血漿PRA、AngⅡ濃度的測(cè)定 處死大鼠后從其心臟取血，將其放入冰水中冷卻的酶抑制劑抗凝管中(50 μL EDTA-2Na、50 μL 8-羥基喹啉、25 μL二硫基丙酸)搖勻放回冰水中冷卻，將其放入離心機(jī)中離心，1 500 r/min，4 ℃離心5 min，吸出血漿，采用放射免疫法測(cè)定AngⅠ、AngⅡ，具體步驟參考說(shuō)明書(shū)；血漿中PRA的測(cè)定以AngⅠ的生成率代替，具體步驟如下：取雙份血漿分為對(duì)照管、測(cè)定管，對(duì)照管在4 ℃下測(cè)定AngⅠ濃度，測(cè)定管在37 ℃下溫育30 min，測(cè)定AngⅠ濃度，AngⅠ生成率=(測(cè)定管濃度-對(duì)照管濃度)/溫育時(shí)間。

1.3.6 Western blot檢測(cè) Western blot法測(cè)定大鼠心肌組織中MMPs、TIMP的蛋白表達(dá)水平，測(cè)定MMPs/TIMPs比值:以組織裂解液提取心肌組織總蛋白，蛋白定量BCA法測(cè)定蛋白總濃度后將樣品稀釋至同一濃度，各取含總蛋白量75 μg樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，印記轉(zhuǎn)染硝酸纖維素膜，常規(guī)漂洗、封閉過(guò)夜，次日將膜放入1∶500稀釋的一抗中，室溫下孵育2 h后，用TBST(含Tris-HCl、NaCl、Tween20 3種物質(zhì)的緩沖液)在室溫下?lián)u床上洗3次，每次 10 min，在放入1∶1 000比例稀釋二抗中，室溫下孵育2 h后，用TBST在室溫下?lián)u床上洗3次，每次10 min，進(jìn)行X光片曝光，將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較 與對(duì)照組相比，ISO組大鼠心臟的LVEDD明顯變大，LVEF明顯減退(P<0.01)。BH組、AL組較ISO組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著改善(P<0.05)。與BH組相比，AL組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著改善(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠二維超聲心動(dòng)圖比較±s，n=10)

a：P<0.01，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，對(duì)ISO組比較；c：P<0.01，與BH組比較。

2.2 各組大鼠心肌病理切片比較 心臟組織學(xué)檢測(cè)和結(jié)果：ISO組心臟表面偏暗，顏色暗紫；對(duì)照組心臟表面光滑，顏色紅潤(rùn)。HE染色光鏡下示：ISO組大鼠心肌細(xì)胞肥大，部分心肌細(xì)胞有嗜酸變性和(或)壞死，病變呈灶性或彌散性分布，主要位于左心室壁，部分大鼠心肌間質(zhì)結(jié)締組織增生，增生的結(jié)締組織呈條索狀；BH組心肌組織病理?yè)p傷明顯輕于ISO組；與BH組相比，AL組心肌細(xì)胞水腫、肥大程度減輕，細(xì)胞形態(tài)接近于正常細(xì)胞；對(duì)照組心肌細(xì)胞大小正常，排列整齊，見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：ISO組；C：BH組；D：AL組。

圖1 各組大鼠心肌病理切片(HE×100)

表2 4周末各組大鼠心臟指數(shù)、PRA、AngⅡ比較

a：P<0.01,與ISO組比較；b：P<0.01,與BH組比較。

2.3 各組大鼠心臟指數(shù)、PRA、AngⅡ比較 各組大鼠心臟質(zhì)量等指數(shù)比較：對(duì)照組、BH組、AL組大鼠心臟指數(shù)、PRA、AngⅡ較ISO組明顯降低(P<0.01)；與BH組相比，AL組大鼠心臟指數(shù)、PRA、AngⅡ明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值 各組大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值比較：對(duì)照組、BH組、AL組大鼠MMPs、MMPs/TIMP較ISO組低(P<0.01)；與BH組相比，AL組大鼠MMPs、MMPs/TIMP明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表3、圖2。

表3 4周末各組大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值比較

a：P<0.01，與ISO組比較；b：P<0.01，與BH組比較。

圖2 各組大鼠MMPs、TIMP濃度比較

3 討 論

血液中兒茶酚胺水平的升高，可導(dǎo)致心肌收縮力增強(qiáng)，心率加快，外周血管收縮，在心力衰竭的早期階段可部分代償血流動(dòng)力學(xué)的異常，但交感神經(jīng)張力持續(xù)過(guò)度增高，可引起一系列的不良反應(yīng)如：心肌代謝增加致血氧消耗明顯增加，心肌β受體密度下調(diào)致心肌收縮力下降，外周血管的收縮致心臟后負(fù)荷過(guò)重，室壁應(yīng)力增加和組織灌注不足，直接的心肌毒性作用，激活PAAS，進(jìn)一步加重外周血管收縮及水鈉潴留，最終引起心室的重構(gòu)。

心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的重要環(huán)節(jié),MMPs是一類(lèi)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分(ECM)有特異降解作用的蛋白水解酶，MMPs通過(guò)調(diào)節(jié)ECM的降解對(duì)抑制心室的重構(gòu)具有重要作用[5-6]，TIMP是具有抑制MMPs活性的一組多功能因子家族,可與TIMP以1∶1的比例形成MMP-TIMP復(fù)合體，從而阻斷MMP與底物結(jié)合，抑制MMP的活性，降低膠原的降解，隨著左室擴(kuò)大和功能障礙的發(fā)展,心肌MMPs 的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增加,同時(shí)伴有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分的改變,MMPs/TIMPs這一膠原降解系統(tǒng)比例失調(diào)可造成心肌中膠原合成降解代謝紊亂并導(dǎo)致心肌發(fā)生纖維化[7]，心力衰竭時(shí)血清中去甲腎上腺素、AngⅡ增加，導(dǎo)致重構(gòu)心肌內(nèi)MMPs的合成增多，導(dǎo)致心肌內(nèi)MMPs和TIMPs的不平衡，即MMP活性增高，而TIMP活性卻不增加，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ISO組MMPs/TIMPs比值明顯高于對(duì)照組、BH組、AL組，與BH組相比，AL組心肌MMPs蛋白表達(dá)更低，MMPs/TIMPs比值下降，這與AL較BH更充分抑制PRA、AngⅡ水平有關(guān)[8-9]，相關(guān)研究證實(shí)[10]，AngⅡ從ACE經(jīng)典途徑生成僅占30%～40%，有60%～70%是從旁路生成，而ACEIS并不能抑制旁路生成的血管緊張素導(dǎo)致PRA、AngⅡ抑制的不充分，目前流行病學(xué)調(diào)查表明PRA、AngⅡ水平與心血管疾病密切相關(guān)，同時(shí)亦有研究表明高水平PRA的冠心病患者其心力衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[11-12]，并且一些臨床試驗(yàn)分析也表明在心力衰竭的患者中，高水平的PRA是患者死亡的重要獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[13-14]，其原因可能與ACEI使用后導(dǎo)致血漿的AngⅡ產(chǎn)生減少，受AngⅡ負(fù)反饋的影響，腎素的釋放明顯增加，PRA明顯增加，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)阿利吉倫干預(yù)組大鼠的PRA、AngⅡ水平較BH組要明顯降低(P<0.01)，血漿PRA、AngⅡ水平的升高最終導(dǎo)致心血管疾病明顯增加。

AL組、BH組的心臟超聲示LVEDD、LVESD明顯小于ISO組，LVEF和FS高于ISO組，心肌的病理改變輕于ISO組，與BH組相比AL組大鼠在心室重構(gòu)改善方面明顯改善，上述結(jié)果顯示BH、AL長(zhǎng)期治療可以改善左室重構(gòu)和心功能，對(duì)心力衰竭具有良好的治療作用，而AL在改善心室重構(gòu)、心功能方面要優(yōu)于BH。

綜上所述，直接腎素抑制劑AL由于更充分抑制血漿PRA、AngⅡ水平，因此可能更加降低重構(gòu)心肌內(nèi)MMPs的合成，抑制心肌纖維化的發(fā)生，在抑制心室重構(gòu)、改善心功能上能發(fā)揮重要作用。

[1]Mochel JP1,Peyrou M,Fink M，et al.Capturing the dynamics of systemic Renin-Angiotensin-Aldosterone System (RAAS) peptides heightens the understanding of the effect of benazepril in dogs[J].J Vet Pharmacol Ther,2013,36(2):174-180.

[2]黃震華.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療心力衰竭作用的比較:目前的觀點(diǎn)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):內(nèi)科學(xué)分冊(cè),2000,27(11):465-468.

[3]De silva L，weir MR．ReIIin inhibition and microalbuminuria development：meaIlingfm predictor of kidney disease progression[J]．Curr Opin Nephrol Hypertens，2010，19：437-443．

[4]Riccioni G.Aliskiren in the treatment of hyptension and organ damage[J].Cardiovasc Ther,2011,29(1):77-87.

[5]Sackner-Bernstein JD.The myocardial matrix and the development and progression of ventricular remodeling[J].Curr Cardiol Rep,2000,2(2):112-119.

[6]Lee RT1,Lammerding J.Signaling pathways that influence extracellular remodeling[J].J Card Fail,2002,8(6):339-343.

[7]Khadjavi A,Valente E,Giribaldi G,et al.Involvement of p38 MAPK in haemozoin-dependent MMP-9 enhancement in human monocytes[J].Cell Biochem Funct,2013,32(1):5-15.

[8]Ohsawa M,Tamura K,Kanaoka T,et al.Addition of aliskiren to Angiotensin receptor blocker improves ambulatory blood pressure profile and cardiorenal function better than addition of benazepril in chronic kidney disease[J].Int J Mol Sci,2013,14(8):15361-15375.

[9]Rajagopalan S,Bakris GL,Abraham WT,et al.Complete renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) blockade in high-risk patients:recent insights from renin blockade studies[J].Hypertension,2013,62(3):444-449.

[10]Campbell DJ1,Woodward M,Chalmers JP,et al.Prediction of myocardial infarction by N-terminal-pro-B-type natriuretic peptide,C-rea ctive protein,and renin in subjects with cerebrovascular disease[J].Circulation,2005,112(1):110-116.

[11]McInnes GT.Renin inhibition:the holy grail of renin-angiotensin system blockade?[J].J Hum Hypertens,2007,21(10):766-769.

[12]Barrios V,Escobar C.Aliskiren in the management of hypertension[J].Am J Cardiovasc Drugs,2010,10(6):349-358.

[13]Tran HA,Schwartzbard A,Weintraub HS.Role of RAAS Inhibition in the Prevention of Cardiovascular Disease[J].Curr Treat Options Cardiovasc Med,2011,13(4):279-288.

[14]De Silva L,Weir MR.Renin inhibition and microalbuminuria development:meaningful predictor of kidney disease progression[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2010,19(5):437-443.

The effect of Aliskren on the treatment of metabolic remodelling of failing heart

LuoShike,ZhouXufeng△,XieDongming

(SecondDepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Ganzhou,Jiangxi341000,China)

Objective To explore the effect of Aliskren on the treatment of metabolic remodelling of failing heart.Methods 40 male SD rats were randomly divided into four groups,normal group,ISO damage group (it adopt celiac injection to copy the animal heart failure model),BH(Benazepril,BH) protect group (on the base of the animal heart failure model,we gave the BH to the rats in the form of intragastrically),AL(Alickiren,AL) protect group(on the base of the animal heart failure model,we gave the AL to the rats in the form of intragastrically),the intervention time was 4 weeks.Four weeks later,survival rates were compared,HE staining were used to evaluate inflammatory infiltration and the form of myocardial cell,the cardiac function tests were performed by Doppler echocardiography procedures and detected PRA,AngⅡ,heart weight/body weight ratio,the myocardial protein expression of MMPs and TIMP (Western blot)were determined,the result of MMPs/TIMPs was calculated.Results In the above the three groups,we can see the obese myocardial cell,the ISO group pathological myocardial injuries and hypertrophy were observed under light microscope;compared with the ISO group and BH group,the indexes (pathological myocardial,heart weight/body weight ratio,the chroma of PRA and AngⅡ) of AL group were significantly decreased (P<0.01).Conclusion In the developing process of chronic heart failure,Alickiren could decrease PRA and inhibit RAAS system sufficiently,and it has advantage in improving cardic function and inhibiting ventricular remodelling.

heart failure;metalloproteinases；Alickiren;plasma renin activity

羅時(shí)珂(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事結(jié)構(gòu)性心臟病研究?！?/p>

，Tel:15879782065；E-mail:15879782065@163.com。

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.21.003

R541.3

A

1671-8348(2015)21-2887-03

2015-01-11

2015-03-30)