哈爾樂哈西·布勒斯別克,徐 健,沈生榮

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

腐乳白斑的化學(xué)組成及其抑制方法的研究

哈爾樂哈西·布勒斯別克,徐 健,沈生榮*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058)

為探尋腐乳白斑的抑制手段,揭示白斑的物質(zhì)基礎(chǔ),以腐乳白斑和不同品牌、不同品種腐乳為供試材料,測定溶解性、燃燒性、氨基酸組成,粗蛋白和鈣離子含量,并通過毛霉菌株誘變、加入抗氧化劑處理研究腐乳白斑的抑制方法。結(jié)果表明:腐乳白斑易溶于甲酸溶液,粗蛋白含量為38.45%,鈣含量為0.05 g/100 g,表明白斑的構(gòu)成是以游離酪氨酸為主的氨基酸等結(jié)晶混合物。不同品牌、不同品種腐乳的氨基酸含量比較發(fā)現(xiàn),白斑的形成與腐乳發(fā)酵工藝有關(guān)。毛霉菌株誘變后的白腐乳氨基酸含量有差異并出現(xiàn)白斑,說明物理誘變毛霉菌并不能徹底解決腐乳白斑問題。調(diào)節(jié)酒精度數(shù)發(fā)現(xiàn),酒精度為13%的腐乳白斑形成率最低。在后期發(fā)酵向配料中加入抗氧化劑大豆異黃酮和茶多酚,在室溫下后發(fā)酵半年,無白斑出現(xiàn),表明抗氧化劑的添加有明顯抑制腐乳白斑形成的作用。

腐乳,白斑,酪氨酸,抗氧化劑

腐乳,俗稱豆腐乳,是中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品,是將大豆制成白腐乳坯經(jīng)接種發(fā)酵、腌制、加料后發(fā)酵等工藝而制成,具有營養(yǎng)豐富,質(zhì)地細(xì)膩、風(fēng)味鮮美等特點(diǎn)[1]。有研究發(fā)現(xiàn),適量食用腐乳可以防止老年性疾病和平衡機(jī)體營養(yǎng)[2]。

腐乳白斑是附著于成熟腐乳表面上的乳白色硬質(zhì)圓粒狀小點(diǎn),有時(shí)呈片狀,常附在腐乳表層松散的毛霉菌絲上,或懸浮于腐乳汁中,或沉積于容器底部,隨著貨架期的延長,腐乳產(chǎn)品的白斑會(huì)越來越多。腐乳出現(xiàn)白斑會(huì)影響產(chǎn)品的外觀,為消費(fèi)者難以接受。雖然腐乳白斑沒有發(fā)現(xiàn)對人體有危害,但該問題一直是業(yè)內(nèi)渴望解決的重要技術(shù)問題。

鮑松林[3]等經(jīng)化學(xué)定性、HPLC定量鑒定、重結(jié)晶顯微鏡觀察等實(shí)驗(yàn),證實(shí)白點(diǎn)是73%～76%的酪氨酸和一些菌絲體。袁振遠(yuǎn)[4]等研究結(jié)果表明腐乳白斑是游離的酪氨酸而不是酪氨酸的金屬鹽。林影[5]的研究表明,當(dāng)游離酪氨酸含量達(dá)到2 mg/g時(shí)即形成“白斑”。李理[6]在研究毛霉蛋白酶對大豆分離蛋白的降解作用時(shí)發(fā)現(xiàn),酶解后的可溶性大豆多肽中酪氨酸的摩爾比比大豆分離蛋白中的酪氨酸的摩爾比明顯增加了。江景泉[7]等的研究討論了產(chǎn)生的原因可能跟酪氨酸釋放有關(guān)的蛋白酶有關(guān),內(nèi)肽酶先作用生成了以酪氨酸為末端的肽鏈,接著再受酪氨酸羧基肽酶的作用生成酪氨酸。

本研究擬對腐乳白斑的化學(xué)組成進(jìn)行較系統(tǒng)的分析,破除過去研究集中在酪氨酸單一因素的局限,較完整分析腐乳白斑在有機(jī)溶劑中的溶解性和粗蛋白、鈣離子等化學(xué)組成及其物質(zhì)基礎(chǔ);在此基礎(chǔ)上以毛霉型腐乳為研究對象,通過毛霉菌株誘變和改變腐乳發(fā)酵工藝條件得到不同產(chǎn)品,對腐乳白斑特征性物質(zhì)及其影響因素進(jìn)行分析,探討腐乳白斑形成與工藝條件之間的關(guān)系;向配料中加入抗氧化劑,以嘗試抑制腐乳白斑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐乳成品:白腐乳、青方腐乳、辣腐乳 浙江省浦江縣萬方腐乳廠提供,麻油白腐乳 超市購買,廣州蓮豐食品有限公司。

實(shí)驗(yàn)室自制腐乳:白坯(萬方腐乳廠提供)→接種→腌制→加料后發(fā)酵。

菌株:雅致放射毛霉菌株(3.2778),微生物實(shí)驗(yàn)室4～8 ℃冰箱保藏。

磺基水楊酸、氫氧化鈉,高氯酸、鹽酸,硝酸,無水乙醚,甲酸,無水乙醇,福林一酚試劑,分析純;混合酸消化液:硝酸∶高氯酸=4∶1。

大豆異黃酮提取物,純度20%,廣西桂林實(shí)力天然食品有限公司;茶多酚(>95%),無錫太陽綠寶科技有限公司。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本日立公司;AA-700原子吸收分光光度計(jì) 日本島津有限公司;L500臺式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 白斑制備:采用常規(guī)方法,用無菌鑷子挑取5瓶某品牌腐乳里懸浮腐乳塊表面和沉在瓶底的白點(diǎn)和白片,混合,用蒸餾水清洗表面殘留菌絲,用濾紙吸干表面水分,自然風(fēng)干,準(zhǔn)確稱取1 g,加入8%磺基水楊酸,混勻溶解,靜置反應(yīng)1 h,取上清液5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,取上清液待測。

腐乳樣品制備:取腐乳成品,濾紙吸干表面水分,均勻研磨成糊狀,準(zhǔn)確稱取1 g,加入8%磺基水楊酸,混勻溶解,靜置反應(yīng)1 h,取上清液5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min,取上清液待用。

1.2.2 溶解性 取白斑少許觀察其在清水、沸水、0.01 mol/L HCl、0.01 mol/L氫氧化鈉溶液、無水乙醇、無水乙醚、甲酸溶液中的溶解情況。

1.2.3 燃燒性 酒精燈火焰常規(guī)法,挑取白斑樣本置于酒精燈的氧化焰上燃燒,觀察其燃燒情況。

1.2.4 粗蛋白含量 采用凱氏定氮法測定。

1.2.5 鈣離子測定 根據(jù)GB/T5009.92-2003《食品中鈣離子的測定》進(jìn)行測定。

1.2.6 氨基酸含量測定 取1.2.1中制備的上清液,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定氨基酸含量[8]。

1.2.7 菌株誘變方法 斜面培養(yǎng)→孢子懸浮液→稀釋待處理液→ Co60照射→處理液分離→平板培養(yǎng)→挑選菌落→初篩、復(fù)篩→平板培養(yǎng)→斜面培養(yǎng)→菌懸液→紫外線處理→處理液分離→平板培養(yǎng)→挑選菌落→初篩、復(fù)篩→平板培養(yǎng)→特性鑒定[9-12]。

1.2.8 抑制腐乳白斑方法 采用不同濃度的大豆異黃酮,茶多酚進(jìn)行抗氧化處理(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1)。在實(shí)驗(yàn)室條件(濕度90%,溫度(21±3)℃)下后期發(fā)酵半年,觀察白斑形成狀況。

表1 抗氧化劑處理

1.2.9 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 7.5和SAS 8.0進(jìn)行,繪圖采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行,數(shù)值表示為平均值±SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 白斑的成分研究

2.1.1 溶解性 白斑樣品在冷水,沸水,0.01 mol/L HCl,0.01 mol/L氫氧化鈉,無水乙醇和無水乙醚溶液中的溶解性不明顯,但易溶于甲酸溶液,溶解時(shí)只有少量菌絲殘留并懸浮在溶液中。

實(shí)驗(yàn)表明腐乳白斑的極性弱,初步判斷主要成分是水不溶性有機(jī)物;易溶于甲酸溶液和不易溶于乙醇和乙醚溶液中,與報(bào)道的酪氨酸的溶解性極其相似[13]。

2.1.2 燃燒性 白斑在酒精燈火焰上迅速完全燃燒,有焦味,變黑色,殘留物少,表明主要成分是有機(jī)物。

2.1.3 粗蛋白含量 凱氏定氮法測定腐乳白斑粗蛋白含量為38.45%±0.045%;說明腐乳白斑粗蛋白含量較高。

2.1.4 鈣離子測定 用原子吸收分光光度計(jì)測定,腐乳白斑鈣離子含量為0.05 g/100 g,含量極少,說明鈣鹽不是白斑的主要成分。

2.1.5 游離氨基酸含量測定 對腐乳白斑進(jìn)行全游離氨基酸檢測結(jié)果表明(見表2),腐乳白斑的主要成分是酪氨酸,其次是苯丙氨酸,其余氨基酸含量較少。白斑氨基酸圖譜見圖1。

表2 白斑的游離氨基酸含量及組成(g/100 g干樣)

圖1 白斑氨基酸分析圖譜Fig.1 Analysis of amino acid composition of white spot

2.2 腐乳白斑形成的影響因素

2.2.1 不同品牌、不同品種腐乳中游離氨基酸的組成 取制備好的腐乳樣品,用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定游離氨基酸含量。結(jié)果表明:腐乳的質(zhì)量和品種不同,氨基酸含量也不同,故不同品牌和不同品種的腐乳產(chǎn)品之間存在差異,具體見表3。辣腐乳、白腐乳和青方腐乳各氨基酸成分的層次基本吻合,各成分中谷氨酸含量最高。但麻油白腐乳與其余腐乳的氨基酸組分和含量有差距,其中亮氨酸含量最高,酪氨酸含量及少,并且未見白斑。同批次的辣腐乳、白腐乳和青方腐乳,白腐乳先產(chǎn)白斑,青方腐乳不產(chǎn)白斑。

2.2.2 腐乳白斑形成與氨基酸含量的相關(guān)性 用同樣工藝制作的同一批腐乳在同樣條件下測定(見圖2),已經(jīng)有白斑的腐乳樣品氨基酸含量(氨基酸總量為4.360 g/100 g)顯著高于無白斑的腐乳(氨基酸總量為2.345 g/100 g)(p<0.01),其中形成白斑的主要因素酪氨酸(Tyr)的含量有白斑樣品明顯高于無白斑樣品(p<0.01),說明白斑的產(chǎn)生是腐乳后發(fā)酵期氨基酸含量的增加所致。

2.2.3 誘變菌株對白斑產(chǎn)生的影響 經(jīng)菌株誘變后,實(shí)驗(yàn)室自制腐乳的氨基酸組成和含量結(jié)果如圖3,處理前樣品的氨基酸總量為1.408 g/100 g,處理后樣品的氨基酸總量為1.870 g/100 g,發(fā)現(xiàn)處理后樣品氨基酸含量顯著性提高(p<0.01),經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)樣品成熟之后仍出現(xiàn)白斑。

表3 不同腐乳的游離氨基酸含量及組成(g/100 g 干樣)

圖2 白斑與氨基酸含量的關(guān)系Fig.2 Relations between white spot and components of amino acids content注:**表示在p<0.01水平下差異顯著。

圖3 毛霉菌誘變處理對腐乳氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of Mucor mutagenesis on the amino acid content of Sufu注:*表示在p<0.05水平下差異顯著,**表示在p<0.01水平下差異顯著。

2.2.4 酒精度對腐乳白斑形成的影響 使用不同酒精度數(shù)的湯料制得白腐乳,進(jìn)行后期發(fā)酵6個(gè)月,以白斑的特征性物質(zhì)酪氨酸和氨基酸組成為指標(biāo)測定氨基酸含量,氨基酸總量結(jié)果如表4,酒精度為13%的腐乳氨基酸含量最低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,出現(xiàn)白斑數(shù)量增多,酒精度為18%的腐乳和酒精度為12%的腐乳發(fā)酵三個(gè)月后先出現(xiàn)白斑,酒精度為13%的腐乳第六個(gè)月開始出現(xiàn)白斑,為最晚。氨基酸各組分含量結(jié)果如圖4,發(fā)現(xiàn)酒精度數(shù)為13%時(shí)酪氨酸含量最低。

表4 不同酒精度腐乳氨基酸總量(g/100 g)

注:1、2、3、4分別為酒精度為12%、13%、18%、20%發(fā)酵腐乳,圖4同。

圖4 酒精度對腐乳白斑的影響Fig.4 Effect of alcohol content on Sufu white spot

2.3 腐乳白斑形成的抑制方法

空白對照和抗氧化劑處理樣氨基酸含量測定結(jié)果如圖5所示,氨基酸總量測定結(jié)果為空白樣品2.157 g/100 g,大豆異黃酮處理樣1.036 g/100 g,茶多酚處理樣0.757 g/100 g,結(jié)果處理樣氨基酸總量和各組分含量均降低,表明在腐乳配料中加入抗氧化劑,可以有效抑制氨基酸含量的增加。

圖5 抗氧化劑處理腐乳的氨基酸含量Fig.5 The amino acid content on different antioxidants of Sufu

空白對照和抗氧化劑處理進(jìn)行對比(見圖6),隨著抗氧化劑添加量的增加,湯料有渾濁和顏色加深現(xiàn)象,其中大豆異黃酮處理組顏色呈黃色,添加茶多酚組顏色變化明顯,變?yōu)樯钭厣?。結(jié)果空白對照樣出現(xiàn)白斑,而處理組樣均未出現(xiàn)腐乳白斑,表明抗氧化劑對腐乳白斑的產(chǎn)生起抑制作用。因此可采取向配料中添加0.05 g大豆異黃酮以防止腐乳白斑生成。

圖6 不同抗氧化劑處理對白斑產(chǎn)生的影響Fig.6 Effect of treatment with different antioxidants on Sufu white spot

3 結(jié)論

腐乳白斑經(jīng)溶解性和燃燒性分析,結(jié)果表明其為有機(jī)物,且溶解特性與酪氨酸極其相似,經(jīng)進(jìn)一步分析其主成分為粗蛋白和以酪氨酸為主的氨基酸的復(fù)合物,粗蛋白含量為38.45%;原子吸收測得腐乳白斑中鈣含量為0.05 g/100 g,表明白斑的構(gòu)成并不是鈣鹽。

雅致放射毛霉菌株(3.2778)經(jīng)誘變處理后實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵白腐乳,發(fā)現(xiàn)處理后樣品氨基酸含量顯著性提高(p<0.01),樣品成熟之后仍出現(xiàn)白斑。

不同品牌和不同品種腐乳的氨基酸分析結(jié)果表明,發(fā)酵工藝對白斑的產(chǎn)生有影響,制作不同酒精度數(shù)的腐乳,后期發(fā)酵六個(gè)月,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,出現(xiàn)白斑數(shù)量增多。酒精度為18%的腐乳和酒精度為12%的腐乳先出現(xiàn)白斑,酒精度為13%的腐乳白斑出現(xiàn)最晚。氨基酸各組分含量結(jié)果也表明酒精度數(shù)為13%時(shí)酪氨酸含量最低。

在后期發(fā)酵過程中,加入抗氧化劑對腐乳白斑的產(chǎn)生有抑制作用,向配料中添加0.05 g大豆異黃酮可以防止腐乳白斑生成。

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Survey for the compounds of white spots of Sufu and their inhibitory method

Harligash.Bolesbek,XU Jian,SHEN Sheng-rong*

(School of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

To explore the material basis of white spots on Sufu and the inhibitory method,the white spots and Sufu of different brands or varieties were used as material to find out the solubility,combustibility,composition of amino acids,and the content of crude protein and calcium ion. And inhibitory method of white spot was studied throughMucorstrain inducing and adding antioxidant and the results were:the white spots of Sufu was soluble in formic acid solution,the content of crude protein was 38.45%,and the content of calcium was 0.05 g/100 g,which showed that the composition of white spot was the consisted of free tyrosine based crystalline mixture. Comparing the content of amino acid of different brands or varieties of the Sufu found that the formation of white spot was related to the process of Sufu. The content of amino acidsinMucorstrain after inducing were differences and white spots were found,which showed that physical inducing ofMucorcannot solve the problem of white spots completely. After adjusting alcohol degrees,13% of alcohol was the least white spots in Sufu. In the later of fermentation,antioxidant soy was oflavones and tea polyphenols were added,and the fermentation under temperature lasted for half a year. The result was no white spots being found,which showed that the addition of antioxidant can inhibit Sufu from white spots obviously.

Sufu;white spot;tyrosine;antioxidants

2015-03-25

哈爾樂哈西·布勒斯別克(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:hah1021@126.com。

*通訊作者:沈生榮(1963-)，男，博士，教授，研究方向：食品分子營養(yǎng)與食品分子影像學(xué)，E-mail:shrshen@zju.edu.cn。

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)(2013C02022-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.031