許小向,洪艷平,胡捷敏,上官新晨,,*,陸 慶,鄒 凱

(1.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗室,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045;2.江西省食品藥品監(jiān)督管理局,江西南昌 330045)

松針多糖微波提取工藝及抗氧化性研究

許小向1,洪艷平1,胡捷敏2,上官新晨1,2,*,陸 慶1,鄒 凱1

(1.江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗室,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045;2.江西省食品藥品監(jiān)督管理局,江西南昌 330045)

采用微波輔助法對松針多糖提取工藝進(jìn)行了研究,通過考察提取溫度、提取時間、提取功率和料液比對松針多糖得率的影響,在單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化,確定了提取的最佳工藝參數(shù)為:提取溫度90 ℃、提取時間10 min、提取功率800 W、料液比1∶14(g·mL-1),提取兩次,在優(yōu)化條件下松針多糖的提取得率最高達(dá)2.1698%;此外,通過測定松針多糖還原能力、清除自由基的能力評價了其抗氧化活性,結(jié)果表明,松針多糖具有一定的抗氧化能力,對DPPH、·OH、ABTS+·的半抑制濃度(IC50)分別為0.291、1.793、0.617 mg/mL。

松針,多糖,微波提取,抗氧化性

松針(Pine needle),松科松屬植物的針狀葉,我國資源較為豐富。研究發(fā)現(xiàn)[1-2],松針中含有蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、纖維素、葉綠素、蘿卜素以及多種氨基酸、維生素和礦物元素等,營養(yǎng)豐富,具有提高動物免疫力等功效,開發(fā)的產(chǎn)品有松針茶、松針精油、松針粉等。近年來大量研究表明[3-4],植物多糖是一種具有多種生理功能和開發(fā)價值的活性多糖,對人體有獨(dú)特的保健功效,許多植物多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗感染、抗?jié)兊榷喾N生理功能。浙江中醫(yī)學(xué)院藥理所研究發(fā)現(xiàn)松針具有顯著抗基因突變、抗DNA損傷、提高小鼠SOD活性及降血脂等作用,說明松針中含有清除自由基的活性成分[5],如松針黃酮、多糖等。目前,已有相關(guān)文獻(xiàn)研究了松針多糖的提取工藝,徐麗珊[6]等采用水提法對濕地松中松針多糖的提取工藝進(jìn)行了研究,許麗麗等[7]采用超聲波輔助法研究了馬尾松松針多糖的提取工藝,但關(guān)于松針多糖抗氧化性方面的研究報道甚少。本文采用微波輔助法提取馬尾松中的松針多糖,克服了水提法耗時長、成本高等缺點(diǎn),并研究其抗氧化活性,為松針多糖在食品、藥品、飼料等領(lǐng)域的進(jìn)一步研究開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾松 校園采摘;無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、三氯乙酸、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)、過硫酸鉀等 分析純。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)真空泵 上海亞榮生化儀器廠;Q-350B3型高速粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司;FA2104V型電子天平 上海青浦儀器有限公司;XH-100B型祥鵠電腦微波催化合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;V-5600型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;TDL-5A型低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;ZD-A30普通型真空冷凍干燥機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 提取工藝流程 松針→除雜→干燥→粉碎→石油醚回流脫脂脫色2次(2 h/次)→95%乙醇回流處理→烘干→微波輔助水提取→抽濾→濾液減壓濃縮→5倍體積95%乙醇沉淀12 h→4000 r/min離心15 min→沉淀物→無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→水復(fù)溶→Sevage法除蛋白5次→蒸餾水4 ℃透析48 h→冷凍干燥→多糖粗品。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于500 mL容量瓶中,蒸餾水定容,制得質(zhì)量濃度為40 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)對照液。分別取其0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于試管中,加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL,再各加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,搖勻冷卻,以蒸餾水做空白對照,室溫放置20 min后在490 nm處測定其吸光值[8]。

1.2.3 松針多糖提取得率的測定 稱取5.0 g松針粉按1.2.1方法制成提取液,定容至250 mL,準(zhǔn)確移取VmL按1.2.2方法測定其吸光值(A),根據(jù)下面公式計算多糖提取得率:

多糖提取得率(%)

1.2.4 微波提取工藝條件優(yōu)化 稱取5.0 g松針粉若干份,分別選取不同提取溫度(65、70、75、80、85、90、95 ℃)、提取時間(6、8、10、12、14、16 min)、提取功率(300、400、500、600、700、800、850 W)、料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶20、1∶25、1∶30(g·mL-1))進(jìn)行單因素實(shí)驗,根據(jù)1.2.3方法計算出的結(jié)果比較不同條件下對松針多糖提取得率的影響。在單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上,以多糖提取得率為考察指標(biāo),選取L9(34)正交設(shè)計以確定提取松針多糖的最佳工藝參數(shù),因素水平設(shè)計見表1,正交實(shí)驗結(jié)果重復(fù)兩次。在正交優(yōu)化條件下進(jìn)行提取次數(shù)實(shí)驗。

1.2.5 松針多糖的抗氧化性實(shí)驗

1.2.5.1 清除DPPH自由基的能力測定 在試管中加入不同質(zhì)量濃度的松針多糖水溶液及等體積的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,混勻后于暗處靜置30 min,以無水乙醇做參比,在波長517 nm處測定其吸光度[9-10]。平行測定3次,取平均值。以VC做陽性對照,比較松針多糖與VC對DPPH自由基的清除效果。清除率計算公式為:

清除率(%)=1-(A2-A1)/A0×100

式中:A0-2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇;A1-2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液;A2-2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液。

表1 正交實(shí)驗因素水平表

1.2.5.2 清除羥基自由基的能力測定 反應(yīng)體系中加入不同質(zhì)量濃度的樣品液、6 mmol/L H2O2、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L水楊酸各2 mL,其中水楊酸最后加入啟動整個反應(yīng),37 ℃水浴30 min后,5000 r/min離心5 min,以蒸餾水為參比,在510 nm下測定吸光度[11-12]。平行測定3次,取平均值。以VC做陽性對照,比較松針多糖與VC對羥自由基的清除效果。清除率計算公式為:

清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

式中:A0-2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水楊酸+蒸餾水;A1-2 mL樣品液+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+2 mL水楊酸;A2-2 mL樣品液+2 mL H2O2+2 mL FeSO4+蒸餾水。

清除率(%)=1-(A1-A2)/A0×100

清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100

1.2.5.5 還原能力的測定 取2.0 mL不同濃度樣品溶液于試管中,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液2.5 mL(pH6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后,快速冷卻,再加入10%三氯乙酸(TCA)2.0 mL,混勻,4000 r/min離心10 min,移取上清液2.5 mL于試管中,加入0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL、蒸餾水2.5 mL,充分混勻常溫反應(yīng)5 min后于700 nm處測定其吸光值A(chǔ),吸光值越大表示還原能力越強(qiáng)[15];以水為空白,各組平行測定3次,取平均值。以VC做陽性對照,比較松針多糖與VC的還原能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在實(shí)驗條件下,以吸光度為橫坐標(biāo),葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸得出方程為y=0.01051x+0.0228,相關(guān)系數(shù)r=0.9997,線性關(guān)系良好,結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 微波提取松針多糖單因素實(shí)驗結(jié)果

不同提取溫度、提取時間、微波功率、料液比對松針多糖提取得率的結(jié)果如圖2所示:

圖2 溫度、時間、微波功率、料液比對松針多糖提取得率的影響Fig.2 Effect of temperature,time,microwave power,solid to solvent ratio on extraction of pine needle polysaccharide

2.2.1 提取溫度對松針多糖提取得率的影響 結(jié)果由圖2A可知:隨著提取溫度的升高,松針多糖提取得率逐漸上升,當(dāng)溫度達(dá)90 ℃時,多糖提取得率最高,當(dāng)溫度高于90 ℃時,多糖提取得率隨溫度的升高而降低,這可能是由于較高的溫度易于細(xì)胞壁破碎而使活性多糖溶出,但溫度過高可能容易導(dǎo)致多糖糖苷鍵斷裂而失活,使得提取出的多糖減少[16],故選擇90 ℃為最佳提取溫度。

2.2.2 提取時間對松針多糖提取得率的影響 結(jié)果由圖2B可知:在一定范圍內(nèi),隨著提取時間的延長,多糖提取得率明顯增加,在12 min時達(dá)到最大,繼續(xù)延長時間提取得率下降,可能是因為多糖分子在高溫條件下時間過長,使得部分多糖降解為單糖,從而影響其提取得率,故提取時間不宜過長,選擇12 min為最佳。

2.2.3 微波功率對松針多糖提取得率的影響 結(jié)果由圖2C可知:微波功率在300～800 W范圍內(nèi),隨著微波功率的增大,多糖提取得率不斷增加,在800 W時達(dá)到最大,但繼續(xù)增大功率,多糖提取得率明顯降低,這可能是由于微波功率太大、輻射過強(qiáng)導(dǎo)致溫度過高使得部分多糖被分解,從而影響其提取得率,故選擇800 W為最佳提取功率。

2.2.4 料液比對松針多糖提取得率的影響 結(jié)果由圖2D可知:多糖提取得率隨著料液比的增大呈先增后減的趨勢,這可能在于溶劑用量影響有效成分浸出液的濃度,從而影響原料內(nèi)部與外部之間提取成分的傳質(zhì)過程。在料液比很小時,短時間內(nèi)多糖的溶出就達(dá)到平衡,不利于多糖的進(jìn)一步溶出,但料液比太大受溶解度的約束作用變小,且水量過多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難,而底物濃度過低使得提取得率呈現(xiàn)下降趨勢[17],故料液比選擇1∶14最佳。

2.3 正交實(shí)驗結(jié)果分析

松針多糖微波提取正交實(shí)驗方案與結(jié)果如表2所示。

表2 正交實(shí)驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理表

表3 正交設(shè)計方差分析表

注:F0.05(2,8)=19.37;F0.01(2,8)=99.36。

由表2、表3分析可知,各因素對松針多糖提取得率影響的主次為A(溫度)>C(功率)>D(料液比)>B(時間),提取溫度對松針多糖提取的影響極顯著,提取功率對松針多糖提取的影響顯著,而提取時間和料液比對松針多糖提取的影響不顯著。綜合極差分析、方差分析和正交實(shí)驗結(jié)果可確定最佳的條件組合為A3B2C3D2，但因素B對結(jié)果影響最小，因此從節(jié)約時間角度考慮，最終選取1水平，即提取溫度90 ℃、提取時間10 min、提取功率800 W、料液比1∶14 g·mL-1。在此工藝條件下進(jìn)行提取級數(shù)實(shí)驗,重復(fù)三次取平均值。結(jié)果由表4可知,前兩次的提取得率占三次提取的99.7%,故提取兩次,且兩次提取得率平均達(dá)2.1698%。

表4 提取次數(shù)結(jié)果

2.4 松針多糖的紫外掃描

取適量除蛋白后的多糖,配成一定濃度的水溶液,在220～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果如圖3所示:在260 nm和280 nm處,松針多糖均未發(fā)現(xiàn)有明顯的特征吸收峰,表明其中不含核酸、多肽和游離蛋白等物質(zhì)。

圖3 松針多糖的紫外光譜Fig.3 Ultraviolet spectrum of pine needle polysaccharide

2.5 松針多糖的抗氧化性實(shí)驗結(jié)果

2.5.1 清除DPPH自由基能力的測定 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的含氮自由基,結(jié)構(gòu)中存在單電子,在乙醇溶液中顯深紫色,在517 nm處有特征吸收;加入抗氧化劑后,DPPH與抗氧化劑中的氫結(jié)合,溶液顏色發(fā)生改變,通過測定吸收減弱的程度來評價清除其自由基能力的強(qiáng)弱[18]。按1.2.5.1方法實(shí)驗,計算不同質(zhì)量濃度的松針多糖和VC對DPPH自由基的清除率,結(jié)果由圖4可知,VC對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用,0.1 mg/mL的VC清除率即可達(dá)到90%以上;松針多糖對DPPH自由基有較好的清除能力,在多糖質(zhì)量濃度為0.2～2.0 mg/mL范圍內(nèi)呈量效關(guān)系,清除率最高達(dá)86.84%,清除DPPH自由基能力稍弱于VC。用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)得出松針多糖對DPPH自由基的半抑制濃度(IC50)為0.291 mg/mL。

圖4 松針多糖和VC對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 DPPH radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.2 清除羥自由基能力的測定 FeSO4與 H2O2反應(yīng)會生成羥自由基,·OH具有很高的反應(yīng)活性,存活時間短,在體系中加入水楊酸后能有效捕捉·OH,并產(chǎn)生有色物質(zhì),該有色物質(zhì)在510 nm處有最大吸收;多糖溶液加入后會與水楊酸競爭羥自由基,使顏色變淺或消失,從而判定其清除羥自由基的能力[19]。按1.2.5.2方法實(shí)驗,計算不同質(zhì)量濃度的松針多糖和VC對·OH的清除率,結(jié)果由圖5可知,松針多糖和VC對·OH都有較好的清除率,松針多糖隨著質(zhì)量濃度的增大,清除率不斷增加,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時,松針多糖對羥自由基的清除率達(dá)55.96%,VC對羥自由基的清除率最高達(dá)99.54%,用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)得出松針多糖對羥自由基的IC50為1.793 mg/mL。

圖5 松針多糖和VC對·OH清除率的影響Fig.5 OH radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

圖6 松針多糖和VC對·清除率的影響Fig. · radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.4 清除ABTS+自由基能力的測定 ABTS在反應(yīng)體系中被氧化后會生成穩(wěn)定的ABTS+自由基,為藍(lán)綠色,在734 nm處有特征吸收。加入自由基清除劑后會使顏色減弱,吸光度下降,從而反映清除其自由基的能力[21]。按1.2.5.4方法實(shí)驗,計算不同質(zhì)量濃度的松針多糖和VC對ABTS+自由基的清除率,結(jié)果如圖7所示,VC的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時清除率即可達(dá)到90%以上,表明VC對ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除能力;松針多糖對ABTS+自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而不斷增大,最高達(dá)71.24%,用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)得出松針多糖對ABTS+自由基的IC50為0.617 mg/mL。

圖7 松針多糖和VC對ABTS+自由基清除率的影響Fig.7 ABTS+ radical-scavenging activities of pine needle polysaccharide and VC

2.5.5 還原能力的測定 鐵氰化鉀在還原性物質(zhì)作用下被還原為亞鐵氰化鉀,酸性條件下亞鐵氰化鉀可與Fe3+反應(yīng)生成在700 nm下具有特征吸收的普魯士藍(lán),生成的普魯士藍(lán)濃度越大,則其吸光值越大,即還原能力越強(qiáng)。物質(zhì)還原力與其抗氧化性呈明顯的相關(guān)性,還原力越強(qiáng),也就是抗氧化性越強(qiáng)[22]。具有抗氧化性的多糖和VC將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀后,與Fe3+作用生成普魯士藍(lán)溶液濃度的高低則可反映物質(zhì)抗氧化能力的強(qiáng)弱。按1.2.5.5方法實(shí)驗,計算不同質(zhì)量濃度的松針多糖和VC的還原能力,由圖8可以看出:VC具有較強(qiáng)的還原能力,松針多糖的還原力在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨濃度的增大而提高,且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系,表明松針多糖具有一定的抗氧化能力,但在測定的濃度范圍內(nèi),其還原力低于VC。

圖8 松針多糖和VC的還原能力Fig.8 Ferric reducing antioxidant power of pine needle polysaccharide and VC

3 結(jié)論

采用微波輔助法對松針多糖的提取工藝進(jìn)行研究,考察提取溫度、提取時間、提取功率和料液比對松針多糖提取得率的影響,在單因素實(shí)驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗優(yōu)化得到最佳微波輔助提取工藝為:提取溫度90 ℃、提取時間10 min、提取功率800 W、料液比1∶14(g·mL-1),提取兩次,優(yōu)化條件下松針粗多糖提取得率最高達(dá)2.1698%。該方法實(shí)用可靠,可用于松針多糖的提取。

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Study on microwave extraction technology and antioxidant activity of Pine needle polysaccharose

XU Xiao-xiang1,HONG Yan-ping1,HU Jie-min2,SHANG GUAN Xin-chen1,2,*,LU Qing1,ZOU Kai1

(1.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Jiangxi provincial food and Drug Administration,Nanchang 330045,China)

The microwave-assistant extraction technology and antioxidant activity of pine needle polysaccharose were studied. The effects of extraction temperature,extraction time,microwave power and solid-liquid ratio on pine needle polysaccharose content were investigated. After single factor experiments,the orthogonal test was carried out to determine the optimum process parameters. The results indicated that the best extraction process conditions were as follows:extraction temperature 90 ℃,extraction time 10 min,microwave power 800 W,solid-liquid ratio 1∶14(g·mL-1). Under optimal conditions,the extraction rate of pine needle polysaccharides up to 2.1698% through extracting two times. Moreover,the antioxidant activity of Pine needle polysaccharose was explored using reduction and free radical scavenging reactions. The results showed that pine needle polysaccharose had an obvious antioxidant activity,the IC50value of DPPH,·OH and ABTS+was 0.291,1.793,0.617 mg/mL,respectively.

Pine needle;polysaccharide;microwave extraction technology;antioxidant activity

2015-02-12

許小向(1990-),女,碩士,研究方向:食品科學(xué),E-mail:18770046825@163.com。

*通訊作者:上官新晨(1962-),男,博士,教授,研究方向:植物資源開發(fā)與利用,E-mail:shangguanxc-818@sina.cn。

國家科技支撐計劃(2013BAD10B04-3);江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜媱?No.KJLD12021)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0222-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.038