羅 玲,蔡 俊,王常高,杜 馨,林建國

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

響應(yīng)面法優(yōu)化異硫鏈霉菌LMZM利用玉米芯粉產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

羅 玲,蔡 俊*,王常高,杜 馨,林建國

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點實驗室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

本研究采用響應(yīng)面法對異硫鏈霉菌LMZM產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。首先利用Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選出影響產(chǎn)酶的4個顯著性因素:玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4。在此基礎(chǔ)上,研究不顯著因素的最低添加量來降低生產(chǎn)成本,然后運用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域,最后利用中心復(fù)合設(shè)計確定顯著性因素之間的交互作用及最佳組成。結(jié)果表明,玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO40.40 g/L,木聚糖酶最大理論酶活可達117.80 U/mL,經(jīng)3次平行實驗驗證,實際酶活平均值為116.63 U/mL與預(yù)測酶活相近,且比優(yōu)化之前的酶活提高了1.28倍。

木聚糖酶,異硫鏈霉菌,響應(yīng)面法,培養(yǎng)基優(yōu)化,玉米芯粉

木聚糖(XyLan)作為半纖維素的主要組成成份,也是植物細(xì)胞壁的重要組成成份,是自然界中僅次于纖維素的多糖,在植物中的總含量大約占1/3左右[1-3]。木聚糖作為重要的可再生資源,廣泛的存在于玉米芯、米糠、甘蔗渣、秸稈、麥麩等農(nóng)副產(chǎn)品中,但難以得到充分的利用。此外,在造紙制漿工業(yè)中富含木聚糖廢料的再利用率低,通常直接排入水中,導(dǎo)致水質(zhì)富營養(yǎng)化,嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境,在我國此現(xiàn)象尤為突出[4]。木聚糖酶是指能夠降解木聚糖成低聚木糖和木糖的一組酶系的統(tǒng)稱,主要包括β-1,4-外切木聚糖酶,β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶[5]。由于部分鏈霉菌菌株能產(chǎn)生較高活性的木聚糖酶,且酶比較單一,纖維素酶活較低,有較高的工業(yè)應(yīng)用價值,因此近年來被廣泛關(guān)注[6]。目前,國內(nèi)外對異硫鏈霉菌產(chǎn)木聚糖酶能力的研究較少,有待進一步發(fā)掘。同時,木聚糖酶在食品、紡織、飼料和造紙工業(yè)等方面都具有廣闊的用途[7]。

目前,用于優(yōu)化發(fā)酵條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法主要為單因素法、正交實驗法和響應(yīng)面分析法。李家群等采用單因素和正交實驗研究用稻草粉在最佳條件下發(fā)酵培養(yǎng)鏈霉菌LH-3,木聚糖酶活力最高為120.30 U/mL[8]。單因素法無法得知因素之間的交互影響,正交實驗只能得到最佳因素水平組合[9]。而響應(yīng)面分析則可以有效、經(jīng)濟的方式更為合理的實驗設(shè)計方案,考慮實驗的隨機誤差,對實驗進行全面的分析[10]。Coman,G.等以Streptomycessp.P12-137利用中心復(fù)合實驗研究以小麥麩皮作碳源產(chǎn)木聚糖酶的情況,其酶活為27.77 UA/mL[11]。Zhicai Zhang等以Rhizopusstolonifer利用中心復(fù)合實驗研究以玉米芯作碳源產(chǎn)木聚糖酶的情況,其酶活為13.90 U/g[12]。

本研究旨利用響應(yīng)面分析方法對異硫鏈霉菌LMZM利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯粉產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行初步優(yōu)化,提高酶活同時,降低原料成本,減少環(huán)境污染,為進一步的放大研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

異硫鏈霉菌LMZM 實驗室篩選保藏;種子培養(yǎng)基(g/L) 可溶性淀粉20、KNO31.0、K2HPO40.5、MgSO4· 7H2O 0.5、NaCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 玉米芯粉 24.4、大豆粉16、KNO38、K2HPO40.4、Na2HPO40.754、MgSO4· 7H2O 0.4;斜面保藏培養(yǎng)基(g/L) 可溶性淀粉20、KNO31.0、K2HPO40.5、MgSO4· 7H2O 0.5、NaCl 0.5、FeSO4· 7H2O 0.01,瓊脂粉20。

AR1140電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-1D型單人凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;臺式高速冷凍離心機3K15 德國Sigma公司;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)箱震蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;2000可見分光光度計(Unic) 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)條件

發(fā)酵周期108 h,發(fā)酵溫度40 ℃,接種量8%,初始pH5.5,裝液量50 mL/250 mL三角瓶,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

1.3 木聚糖酶活力的測定

DNS法測定還原糖(以木糖為標(biāo)準(zhǔn)品):發(fā)酵液8000 r/min離心10 min,所得上清液即為粗酶液。粗酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù),取1.5 mL 1%木聚糖溶液加入25 mL比色管,加0.5 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液后置于60 ℃水浴中反應(yīng)10 min,加入3 mL DNS溶液,其混合物在沸水浴中加熱10 min后,立即冷卻至室溫,定容至25 mL,540 nm波長下測定吸光值,對照用滅活酶液代替粗酶液。用木糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光值經(jīng)曲線對比得出木糖含量后計算木聚糖酶活力[13-14]。木聚糖酶酶活力單位定義為每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol木糖所需要的酶量。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 Plackett-Burman設(shè)計 Plackett-Burman設(shè)計是以最少實驗次數(shù)找到對木聚糖酶活有顯著性影響的因素(可信度大于95%的因素作為主效應(yīng))的實驗方法。對于N次實驗至多可研究(N-1)個因素,每個因素取兩個水平:高水平和低水平[15]。通過該設(shè)計進行實驗,篩選出顯著性因素進行下一步的實驗。根據(jù)前期的單因素實驗結(jié)果,實驗選取的因素共有8個,虛擬項3個,每個因素取2個水平,Plackett-Burman實驗設(shè)計的各因素和水平,見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計各因素與水平

1.4.2 最低添加量實驗 在PLackett-Burman實驗設(shè)計得出不顯著因素基礎(chǔ)上,以培養(yǎng)基最節(jié)省為目的研究不顯著因素的最低添加量,依據(jù)各因素效應(yīng)合理設(shè)計變化步長,設(shè)計最低添加量實驗表頭,進行實驗。

1.4.3 最陡爬坡實驗 在PLackett-Burman實驗設(shè)計得出的顯著性因素后,對其最佳值區(qū)域進行進一步確定的實驗方法。找到拐點,為后續(xù)的中心復(fù)合設(shè)計提供實驗依據(jù)。根據(jù)顯著性因素效應(yīng)值確定變化步長,近一步靠近最佳值區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman實驗的結(jié)果,做最陡爬坡實驗。

1.4.4 Central composite design(CCD)設(shè)計 以爬坡設(shè)計得出的實驗結(jié)果為依據(jù)進行CCD設(shè)計,見表2,用軟件Design expert 8.0.6對實驗進行實驗設(shè)計回歸分析,確定顯著性因素的最佳添加量,依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面三維立體分析圖。

表2 中心復(fù)合設(shè)計各因素與水平

1.5 驗證實驗

用2.4中心復(fù)合設(shè)計實驗結(jié)果的培養(yǎng)基組成預(yù)測值進行3次平行實驗,搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)測定酶活,酶活取平均值,以驗證模型是否可靠,進而確定最終優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

表4 Plackett-Burman 設(shè)計回歸分析

注:*α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計

Plackett-Burman實驗結(jié)果見表3。從Plackett-Burman 設(shè)計回歸分析(表4)看出,該回歸模型的p值(prob>F)為0小于0.05,則該模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著。玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4的p值分別為0.004、0.030、0.027和0.042,均小于0.05,則玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著,而K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4和CaSO4的p值分別為0.160、0.413、0.101和0.180,均大于0.05,則K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4和CaSO4在95%的置信區(qū)間內(nèi)不顯著。其決定系數(shù)R2=0.7836說明回歸方程可以解釋高達78.36%的實驗數(shù)據(jù)。

2.2 最低添加量實驗

根據(jù)PLackett-Burman實驗,由于R2=0.7836<0.9，因此為了進一步提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，對不顯著因素K2HPO4、NaH2PO4、NaH2PO4和CaSO4做最低添加量實驗。

由圖1A知,隨著NaH2PO4添加量的增加,木聚糖酶活逐漸減小,當(dāng)添加量為0 g/L時,木聚糖酶活最高,為90.97 U/mL;由圖1B知,隨著CaSO4添加量的增加,聚糖酶活逐漸減小,當(dāng)添加量為0 g/L時,木聚糖酶活最高,為90.97 U/mL;由圖1C知,Na2HPO4木聚糖酶活逐漸增大,當(dāng)添加量為0.40 g/L,木聚糖酶活最高,為93.17 U/mL;由圖1D知,隨K2HPO4添加量的增加,木聚糖酶活逐漸增大,當(dāng)添加量為0.60 g/L時,木聚糖酶活最高,為93.83 U/mL。故選擇NaH2PO4、CaSO4、Na2HPO4和K2HPO4的添加量分別為0、0、0.40、0.60 g/L。

圖1 最低添加量的實驗設(shè)計與結(jié)果Fig.1 The design and result of minimum amount

2.3 最陡爬坡實驗

為了進一步提高木聚糖酶活,尋求發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合,根據(jù)PLackett-Burman實驗的回歸分析和方差分析,玉米芯粉和MgSO4為正效應(yīng),則說明隨著添加量水平逐步升高,木聚糖酶活也會得到提高。反之,大豆粉、酵母粉為負(fù)效應(yīng),說明隨著其添加水平的逐步降低,木聚糖酶活將會得到提高。據(jù)此,設(shè)計了最陡爬坡實驗,見表5。

表3 Plackett-Burman 設(shè)計及結(jié)果

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

由表5知,第3組木聚糖酶活最高,即玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4的用量分別為35、15、6和1.4 g/L時,酶活為110.52 U/mL,隨著運行序的進一步增加,木聚糖酶活逐漸降低。故選擇玉米芯粉、Na2HPO4的添加量分別為35、15、6和1.4 g/L作為中心復(fù)合設(shè)計的原點。

2.4 中心組合實驗設(shè)計(Central composite design)

2.4.1 模型的建立及顯著性檢驗 根據(jù)中心組合實驗設(shè)計原理,根據(jù)上述實驗結(jié)果,設(shè)計玉米芯粉、大豆粉、酵母粉和MgSO4進行中心復(fù)合實驗,每個因素選5個水平,以木聚糖酶活力為響應(yīng)值作響應(yīng)面設(shè)計,實驗設(shè)計的各因素和水平,見表2。6個中心點、30次實驗設(shè)計及結(jié)果和預(yù)測見表6。

表6 中心復(fù)合設(shè)計及結(jié)果

由響應(yīng)面的回歸分析(表7)知,模型的p值(prob>F)小于0.05,說明模型具有顯著性,該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2(預(yù)測)=0.9713,明預(yù)測僅有2.87%的變異情況不能由該模型解釋,失擬項p值為0.1076 表明失擬項不顯著,模型沒有失擬現(xiàn)象。X1、X2、X4對酶活的影響顯著,X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4的交互影響顯著,X12、X22、X32、X42對酶活的影響均顯著。

通過二次模型回歸系數(shù)的計算,得到如下方程以表征4個因素對木聚糖酶活力的影響:

表7 中心復(fù)合設(shè)計回歸分析

Design Expert 8.0.6分析解得最優(yōu)值點為X1=-1.43,X2=0.50,X3=-1.27,X4=-1.12即質(zhì)量濃度分別為玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO4為1.18 g/L,預(yù)測最大酶活117.80 U/mL。

2.4.2 響應(yīng)面顯著性交互作用圖分析 根據(jù)預(yù)測公式建立顯著性交互作用的三維立體圖,觀察其對木聚糖酶活的影響。

圖2 玉米芯粉和大豆粉的交互作用對木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface for interaction effects of corncob and soybean on xylanase activity

由圖2知,當(dāng)玉米芯粉質(zhì)量濃度較高時,大豆粉對木聚糖酶的產(chǎn)生沒有顯著性影響,同時玉米芯粉編碼水平取0水平附近時,木聚糖酶活較高。圖3知,當(dāng)玉米芯粉和酵母粉的編碼水平分別從-0.2到0.5、從0到0.8之間時,木聚糖酶的酶活皆高于100 U/mL。由圖4知,編碼水平取0水平附近時,木聚糖酶活較高。由圖5知,當(dāng)大豆粉和MgSO4的編碼水平分別從-0.4到0.5、從-0.5到0.2之間時,木聚糖酶的酶活皆高于102 U/mL。由圖6知,當(dāng)酵母粉粉和MgSO4的編碼水平分別從-0.3到0.7、從-0.5到0.5之間時,木聚糖酶的酶活皆高于104 U/mL。

圖3 玉米芯粉和酵母粉的交互作用對木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface for interaction effects of corncob and yeast extract on xylanase activity

圖4 玉米芯粉和硫酸鎂的交互作用對木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface for interaction effects of corncob and MgSO4 on xylanase activity

圖5 大豆粉和硫酸鎂的交互作用對木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for interaction effects of soybean and MgSO4 on xylanase activity

圖6 酵母粉和硫酸鎂的交互作用對木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for interaction effects of yeast extract and MgSO4 on xylanase activity

2.5 驗證實驗

用CCD設(shè)計得到的最佳培養(yǎng)基組成:玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO40.40 g/L作3次重復(fù)驗證性實驗,酶活平均值為116.63 U/mL。實測值與回歸方程預(yù)測值(117.80 U/mL)吻合良好,由此可見,用該回歸模型優(yōu)化Streptomyces althioticus LMZM 木聚糖酶的培養(yǎng)成分是可行的,且具有實用價值。此外,與培養(yǎng)基優(yōu)化前的最大酶活力(51.73 U/mL)相比,提高了1.28倍。

3 結(jié)論

本研究從各種土樣中篩選出木聚糖酶生產(chǎn)菌株異硫鏈霉菌LMZY,利用響應(yīng)面法對其液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化,培養(yǎng)基組成:玉米芯粉27.85 g/L、大豆粉16.25 g/L、酵母粉3.46 g/L、MgSO41.18 g/L、K2HPO40.60 g/L、Na2HPO4為0.40 g/L,最高產(chǎn)酶活力可達116.63 U/mL,與理論最大酶活力117.80 U/mL 接近,說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化異硫鏈霉菌LMZM產(chǎn)木聚糖酶是合理可靠的,且酶活力比培養(yǎng)基成分優(yōu)化前提高1.28倍。同時,本文以廉價的農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯為碳源,未經(jīng)化學(xué)藥品處理直接發(fā)酵產(chǎn)酶,大大降低預(yù)處理和原料成本,減少環(huán)境污染,具有環(huán)保及經(jīng)濟的雙重效益。

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Study on optimization of culture medium for xylanase production by Streptomyces althioticus LMZM using response surface methodology with corncob

LUO Ling,CAI Jun*,WANG Chang-gao,DU Xin,LIN Jjian-guo

(Key Laboratory of Fermentation Engineering(Ministry of Education),Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China.)

In this study,response surface methodology(RSM)was employed to optimize a fermentation medium for the production ofStreptomycesalthioticusLMZM in submerged fermentation with corncob as substrate. Four significant influence factors including corncob powder,soybean,yeast extract powder and magnesium sulfate were screened by the method of Plackett-Burman design. In addition,the minimum addition amount experiment was used for finding out the minimum add amount of non-significant factors to reduce the source cost. The steepest ascent design was applied to approach the optimal region of the three significant factors. And the optimal concentration and correlations among three factors were identified by central composite design. The optimal fermentation parameters for enhanced xylanase production were found to be corncob powder 27.85 g/L,soybean 16.25 g/L,yeast extract powder 3.46 g/L,magnesium sulfate 1.18 g/L,potassium phosphate dibasic 0.60 g/L and disodium hydrogen phosphate 0.40 g/L. The model predicted a xylanase activity of 117.80 U/mL. After three parallel verifications,the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test which was 116.63 U/mL,and the xylanase production was increased by 1.28-fold in comparison with to that before optimization

xylanase;Streptomycesalthioticus;RSM;medium optimization;corncob

2015-02-13

羅玲(1990-),女,碩士,研究方向:發(fā)酵過程優(yōu)化與放大,E-mail:jkrjll@live.com。

*通訊作者:蔡俊(1968-),男,博士,教授,研究方向:發(fā)酵過程優(yōu)化與放大,E-mail:hgcaijun@126.com。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0266-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.046