李巖，張亞卓，郭璐，王宇，王向紅

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，河北保定071001）

在200多年前，人們就注意到植物中還存在一類耐鹽植物—鹽生植物。鹽生植物是一類隱域性植物，它的生長(zhǎng)繁殖生境就是鹽漬土壤，因此，哪里有鹽漬土壤，哪里就有鹽生植物[1]。我國(guó)鹽生植物資源非常豐富，它的種類約占世界鹽生植物種類的三分之一，其中有許多種類具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。翅堿蓬屬于黎科堿蓬屬，又名黃蓿菜、黃須菜、皇席菜、堿蓬草、黃莖菜、堿蓬、堿蓬棵等[2]，為一年生的草本植物，高20 cm～80 cm，綠色，晚秋變紅紫色。翅堿蓬在我國(guó)分布的面積很廣，遍布北方沿海各地，生于鹽堿土、堿斑地、泥灘及泥灘附近路邊草叢。翅堿蓬幼芽具有開(kāi)胃、刺激食欲的作用，但是，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分的研究確鮮有報(bào)道，特別是對(duì)其黃酮類化合物的研究也鮮有報(bào)道。

黃酮類化合物是一種廣泛存在于自然界中的多酚類化合物，它們不僅數(shù)量繁多、種類多樣，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜。近年來(lái)的研究證明，黃酮類化合物能夠防治呼吸系統(tǒng)的疾病，防治血管硬化，具有降低血糖、抗癌、抗腫瘤以及提高免疫能力等功能，還有許多的黃酮類化合物被證明具有抗HIV病毒活性的重要功能[3]。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物有可能是除了VC類和胡蘿卜素類以外的另一類重要的天然強(qiáng)抗氧化劑[4-5]。因此，對(duì)于黃酮類化合物抗氧化活性的研究必然成為今后的研究重點(diǎn)。自由基的清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化性能的一個(gè)重要指標(biāo)[6]。

本研究擬采用超聲波輔助萃取法提取翅堿蓬中黃酮類物質(zhì)，對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期翅堿蓬黃酮的含量變化進(jìn)行研究，并對(duì)翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)黃酮類物質(zhì)對(duì) DPPH·、OH·、ABTS·+的清除作用進(jìn)行初步分析，以期對(duì)灘涂鹽生植物翅堿蓬的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

翅堿蓬：2012年采于河北滄州地區(qū)；石油醚（60℃～90℃）：天津市華東試劑；蘆丁對(duì)照品（≥99%）：中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)；無(wú)水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉（分析純）：天津市華東試劑廠；鄰二氮菲（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑；硫酸亞鐵、ABTS、雙氧水（分析純）：北京市中聯(lián)化工。

1.2 儀器

BS214D分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；101-OAB電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；QE-100 g萬(wàn)能粉碎機(jī)：浙江屹立工貿(mào)有限公司；UV-2800H紫外分光光度計(jì)；尤尼柯儀器有限公司；XMTD-6000恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)風(fēng)儀表公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；QTSX6150型超聲波清洗器：天津市瑞普電子儀器公司；TGL16M離心機(jī)：長(zhǎng)沙易達(dá)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

將采集好的翅堿蓬，清洗干凈后，至于45℃烘箱內(nèi)烘干，取出后用粉粹機(jī)徹底粉碎并過(guò)40目篩，備用。

1.2.2 黃酮的提取

稱取所得樣品1 g放置于100 mL三角瓶中，加10 mL石油醚（60℃～90℃），超聲輔助提取30 min，除去脂肪，揮干溶劑，加40 mL 70%甲醇，浸泡45 min，超聲輔助提取20 min，提取液在4 500 r/min離心處理15 min，重復(fù)1次，合并提取液。棄去沉淀得到總黃酮提取液，放于50 mL的容量瓶中，定容。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取在120℃充分干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用95%的乙醇溶解，定容到10 mL的容量瓶中，再精確從中量取5 mL至50 mL的容量瓶中，用95%的乙醇稀釋定容，得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL具塞試管中，用95%乙醇加至5 mL，加人0.5 mL的5%的NaNO2溶液，混勻后，靜置6 min；加人0.5 mL的10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后，靜置6 min；最后加入4%的NaOH溶液4 mL，搖勻，放置5 min～10 min。以試劑空白為對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在510 nm測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值。

1.2.4 翅堿蓬提取液對(duì)DPPH·的清除作用[7-8]

DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，當(dāng)有清除劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸光度下降。因此，通過(guò)測(cè)定吸光度下降的強(qiáng)弱程度來(lái)評(píng)價(jià)該物質(zhì)清除自由基的能力。

DPPH·溶液的配制：精密稱取50 mg DPPH·，用無(wú)水乙醇溶解并定容至250 mL，得到濃度為0.5 mmol/L的DPPH·母液，與4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

DPPH·使用液配制：準(zhǔn)確量取DPPH·母液40 mL，用無(wú)水乙醇定容至100 mL。

DPPH·清除率的測(cè)定：取1.2.2所得翅堿蓬黃酮提取液，稀釋為 10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 2 mL與等體積的0.2 mol/L的DPPH·溶液加入同一試管中，搖勻。避光放置30 min。在517 nm測(cè)定其吸光度Ai。

清除率/%=（1-Ai-Aj/Ac）× 100

式中：Ai為待測(cè)液+DPPH·在517 nm測(cè)定其吸光度；Ac為無(wú)水乙醇+DPPH·在517 nm測(cè)定其吸光度；Aj為待測(cè)液+無(wú)水乙醇在517 nm測(cè)定其吸光度。

1.2.5 翅堿蓬提取液對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定[9-10]

取1.2.2所得翅堿蓬黃酮提取液，稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 1 mL 依次向樣液中加入 2 mL磷酸鹽緩沖液、2 mL鄰二氮菲、2 mL硫酸亞鐵溶液、1 mL濃度為0.1%雙氧水，充分混勻后在532 nm處測(cè)其吸光度。

清除率/%=[（A0-A1）/（A2-A1）]×100

式中：A1為70%乙醇代替樣液所測(cè)的吸光度；A2為用70%乙醇替代H2O2所測(cè)的吸光度。

1.2.6 翅堿蓬提取液對(duì)ABTS+·清除率的測(cè)定[11-12]

準(zhǔn)備稱取100 mg過(guò)硫酸鉀于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到2.6 mmol/mL過(guò)硫酸鉀溶液；準(zhǔn)確稱取203 mg ABTS于50 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，得到7.4 mmol/mL的ABTS溶液。將上述兩種溶液混合，室溫避光靜置24 h，為ABTS+·儲(chǔ)備液。在4℃避光儲(chǔ)存。臨用前用無(wú)水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光值為 0.7±0.02，即為 ABTS+·工作液。

取1.2.2所得翅堿蓬黃酮提取液，稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL，取 1 mL 再加入 4 mL 的 ABTS+·工作液，立即混勻，避光，室溫下靜置10 min。以5 mL無(wú)水乙醇為空白，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)量其吸光度值。

清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0× 100

式中：A0為無(wú)水乙醇代替樣品液的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2的空白對(duì)照吸光度；A1為樣品的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 翅堿蓬黃酮類化合物濃度測(cè)定的結(jié)果

在510 nm處測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，線性回歸后，得標(biāo)準(zhǔn)溶液與吸光度的線性曲線為：y=11.443x+0.000 3，R2=0.999 9。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期的總黃酮含量。

為了考察河北滄州地區(qū)翅堿蓬黃酮資源，本研究對(duì)翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期的黃酮含量進(jìn)行了比較和分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期的總黃酮含量Fig.2 Total flavonoid contents of saline seepweed leaves

試驗(yàn)結(jié)果表明，翅堿蓬的總黃酮含量在6.7851mg/g～14.47 mg/g之間。其中花期總黃酮含量差異較明顯。在3個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，翅堿蓬花期的總黃酮含量最高。其含量約為發(fā)芽期和展葉期的2倍。因此，在以后對(duì)翅堿蓬黃酮資源的開(kāi)發(fā)與利用方面，可以盡量選擇處在花期的翅堿蓬。

2.2 翅堿蓬黃酮對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·自由基清除能力被廣泛用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抗氧化能力[13]。翅堿蓬黃酮對(duì)DPPH·的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 翅堿蓬黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.3 DPPH radical scavenging activity of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由圖3可以看出，在不同生長(zhǎng)時(shí)期的翅堿蓬黃酮提取液對(duì)DPPH·均具有一定的清除作用，并且，清除能力具有相似的變化趨勢(shì)，即在一定的范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，翅堿蓬黃酮提取液清除能力增強(qiáng)。在10 μg/mL～60 μg/mL變化比較明顯。翅堿蓬在花期的總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除率明顯高于其在發(fā)芽期和生長(zhǎng)期的清除率。翅堿蓬在花期的最大清除率為94.37%，隨后逐漸降低：發(fā)芽期和展葉期均在80 μg/mL到達(dá)最大，分別為82.44%、78.94%。

2.3 翅堿蓬黃酮對(duì)OH·的清除作用

羥自由基被認(rèn)為是一種影響疾病與加速衰老的最直接的自由基，它可以引發(fā)機(jī)體內(nèi)組織細(xì)胞病變[14]。翅堿蓬總黃酮提取液對(duì)OH·的清除作用見(jiàn)圖4。

圖4 翅堿蓬黃酮對(duì)OH·的清除作用Fig.4 The·OH radical scavenging ability of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由圖4可以看出，在不同生長(zhǎng)時(shí)期的翅堿蓬黃酮提取液對(duì)OH·均具有一定的清除作用，并且，清除能力具有相似的變化趨勢(shì)。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，翅堿蓬總黃酮提取液對(duì)OH·的清除作用增大，在 10 μg/mL～60 μg/mL 的范圍內(nèi)，變化比較明顯。翅堿蓬在花期的總黃酮提取液對(duì)OH·的清除作用要大于在發(fā)芽期和展葉期的清除作用，在60 ug/mL達(dá)到最大的清除率，為84.21%。而發(fā)芽期和展葉期的總黃酮提取液均在80 ug/mL達(dá)到最大的清除率，分別為82.30%和72.45%。

2.4 翅堿蓬黃酮對(duì)ABTS+·的清除作用

ABTS+·自由基經(jīng)常被用于測(cè)量天然產(chǎn)物的總抗氧化能力[15]。翅堿蓬總黃酮提取液對(duì)ABTS+·的清除作用見(jiàn)圖5。

圖5 翅堿蓬黃酮對(duì)ABTS+的清除作用Fig.5 The ABTS radical scavenging ability of total flavonoids extract from saline seepweed leaves

由圖5可知，在不同生長(zhǎng)時(shí)期的翅堿蓬黃酮提取液對(duì)ABTS+·均具有一定的清除作用，并且，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著黃酮濃度的增加，翅堿蓬總黃酮提取液對(duì) ABTS+·的清除作用增大，在 0 μg/mL～60 μg/mL的范圍內(nèi)，變化比較明顯。翅堿蓬在花期的總黃酮提取液對(duì)ABTS+·的清除作用要大于在發(fā)芽期和展葉期的清除作用，在40 μg/mL達(dá)到最大的清除率，為93.30%。而發(fā)芽期和展葉期的總黃酮提取液均在60 μg/mL達(dá)到最大的清除率，為80.4%和82.35%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，翅堿蓬黃酮的含量越高，抗氧化活性就越強(qiáng)?？寡趸钚缘牟煌锌赡芘c翅堿蓬中所含有的黃酮的種類有關(guān)。翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期的黃酮提取液在60 μg/mL時(shí)，都具有較強(qiáng)的清除 DPPH·，OH·，ABTS+·的能力。但是，其抗氧化能力的強(qiáng)弱并不相同，這可能表示翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)所含有的黃酮類化合物的種類或者是所含有的黃酮類化合物組分的比例不同。清除能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)時(shí)期有可能是由于含有較高的抗氧化能力的黃酮類物質(zhì)，而翅堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期黃酮類化合物的種類及抗氧化活性的變化有待進(jìn)一步研究。

翅堿蓬在沿海灘涂廣泛存在，并且具有較強(qiáng)的抗氧化性。因此，翅堿蓬黃酮是一種很有開(kāi)發(fā)潛力的天然抗氧化劑，具有廣泛的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。

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