唐慧慧，杜 珍，蔡清宇

吳茱萸次堿是Asahina于1915年首次從吳茱萸中分離出來的一種生物堿［1］，屬喹唑啉酮咔啉生物堿，相對分子質(zhì)量282.37，難溶于水和甲醇、乙醇，微溶于氯仿、二甲基亞砜，是屬于難溶于水的藥物。研究發(fā)現(xiàn)它們具有許多潛在的藥用價值，包括心臟保護(hù)作用［2］、胃黏膜保護(hù)作用［3］、抗炎［4］、抑菌、抗過敏［5］、抗動脈粥樣硬化［6］、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖［7］、免疫抑制［8］、抗癌［9］等生物活性。其抗高血壓作用可能與激動辣椒素受體(VRl)，促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)CGRP的合成和釋放有關(guān)［10-11］，且對心臟具有保護(hù)作用。因此，吳茱萸次堿可能是一種潛在的新型抗高血壓藥物。

羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)近年來開發(fā)的一種藥用輔料，具有水溶解度高，熱穩(wěn)定好，對腎臟無毒，對肌肉和黏膜幾乎無刺激性、溶血作用小，可用于改善藥物的生物利用度，改變藥物狀態(tài)便于制劑，掩蓋藥物的不良?xì)馕逗徒档痛碳ば?，促進(jìn)藥物的吸收，是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的第1個可供靜脈注射的β-CD衍生物。因此，HP-β-CD在藥物制劑領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［12-14］。

本研究采用包合技術(shù)，制備吳茱萸次堿-HP-β-環(huán)糊精包合物，以提高吳茱萸次堿水溶性，通過粉末X射線衍射法，紅外光譜法以及差示掃描量熱法對包合物進(jìn)行了鑒定和表征，采用高效液相色譜法測定了包合物的溶解度，為吳茱萸次堿新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

Bruker D8 ADVANCE X-Ray粉末衍射儀(德國)，NETZSCH DSC 204 F1差示掃描量熱儀(德國)，Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電公司Thermo)，Agilent 1200高效液相色譜儀(美國)。

1.2 試劑

吳茱萸次堿(C11H14N2O1，陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度 ＞98.5%)，HP-β-環(huán)糊精(北京西美杰科技有限公司)，吳茱萸次堿對照品(批號110802-201006，中國食品藥品檢定研究院)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物的制備

采用超聲法制備吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物。稱取與HP-β-CD等摩爾比的吳茱萸次堿樣品，用10 mL無水乙醇溶解，HP-β-CD用適量蒸餾水溶解，將吳茱萸次堿乙醇溶液緩慢加入HP-β-CD的水溶液中，于40℃下置于超聲清洗儀上，在300W的功率下超聲4 h，超聲完成后，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液冷凍干燥即得吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物。

吳茱萸次堿-HP-β-CD物理混合物的制備:按照摩爾比1∶1精密稱取HP-β-CD與吳茱萸次堿樣品，放入研缽中輕輕研磨30 s，即得吳茱萸次堿-HP-β-CD物理混合物。

2.2 包合物的鑒定與表征分析

2.2.1 粉末X射線衍射(PXRD)實(shí)驗(yàn) X射線衍射圖譜的攝取采用D8 ADVANCE vertical goniometer，Ni-filter單色器，Theta/Theta連續(xù)掃描，電壓 40 kV，電流40 mA，掃描速度8°/min，LynxEye檢測器，掃描范圍3°～80°。結(jié)果見圖1。

由圖譜可見吳茱萸次堿為晶態(tài)化合物，表現(xiàn)為尖銳的特征衍射峰，HP-β-CD為非晶態(tài)化合物，表現(xiàn)為寬的彌散衍射峰;吳茱萸次堿-HP-β-CD物理混合物的主要衍射峰為兩種成分的疊加，吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物為非晶態(tài)化合物，表現(xiàn)為彌散衍射峰，從包合物的圖譜中未見吳茱萸次堿的衍射峰，這說明通過包合制備過程吳茱萸次堿與HP-β-CD形成新的物相。

圖1 粉末X射線衍射圖譜

2.2.2 差示掃描量熱分析(DSC)測定 樣品的DSC采用NETZSCH DSC 204 F1型差熱分析儀測定，N2氣流保護(hù)，空鋁坩堝作參比物，掃描范圍30～330℃，升溫速率10℃/min。測定結(jié)果見圖2。

圖2 差方掃描星測定圖譜

DSC測定結(jié)果表明，吳茱萸次堿在262.29℃有尖銳的吸熱峰，表明吳茱萸次堿為晶態(tài)化合物，HP-β-CD在60.81℃有1個寬化的吸熱峰，表明 HP-β-CD為非晶態(tài)，吳茱萸次堿-HP-β-CD物理混合物在84.29℃仍可見 HP-β-CD的吸熱峰，但在262℃左右，未見吳茱萸次堿的吸熱峰，表明，在加熱過程中。吳茱萸次堿與HP-β-CD發(fā)生共融。而吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物中在測定范圍中未見明顯的HP-β-CD和吳茱萸次堿的熔點(diǎn)吸熱峰，表明了新的物質(zhì)的生成。結(jié)果見圖2。

2.2.3 紅外光譜分析(IR) 紅外光譜測定采用傅里葉變換紅外光譜儀:Nicolet 5700型，美國熱電公司(Thermo)，光譜范圍 4 000 ～650 cm－1，分辨率4.000 cm－1，掃描16 次。

圖3 紅外光譜測定圖譜

紅外光譜分析表明，吳茱萸次堿的紅外光譜中可見明顯的C O、苯環(huán)、NH紅外吸收峰，通過超聲法獲得吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物，包合物中主要體現(xiàn)環(huán)糊精的C—O伸縮振動，吳茱萸次堿的骨架C C、C O的伸縮振動特征峰發(fā)生變化，氫鍵區(qū)向長波數(shù)方向移動，表明吳茱萸次堿與HP-β-CD產(chǎn)生了包合作用。

2.3 包合物的溶解度測定

2.3.1 測定波長的選擇 分別將HP-β-CD、吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物的水溶液和吳茱萸次堿的甲醇溶液在190～400 nm波長范圍進(jìn)行紫外掃描，吳茱萸次堿溶液在213 nm，343 nm與360 nm波長處有強(qiáng)烈而穩(wěn)定的吸收峰，吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物水溶液與吳茱萸次堿的最大吸收波長一致，而HP-β-CD的最大吸收在205 nm。故最終選擇343 nm為檢測波長。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取吳茱萸次堿對照品12.50 mg，移至50 ml容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為250 mg/L儲備液。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，至 10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，獲得7種梯度濃度樣品。分別精密吸取7種濃度溶液各10 μl注入液相色譜儀，檢測條件:色譜柱Agilent Eclipse XDB C18(250×4.6 mm，5 μm);乙腈為流動相;0.5%冰醋酸水溶液(75∶25);流速1.0 ml/min;柱溫 30 ℃;進(jìn)樣量 10 μl;重復(fù)進(jìn)樣 3次，記錄色譜圖及峰面積，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=44.752X+72.952(r=0.999 3，n=7)，在5 ～150 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 方法學(xué)考察 按照藥典要求，分別精密稱取一定量的吳茱萸次堿，加甲醇溶解，制成相應(yīng)的溶液，進(jìn)行精密度考察，重復(fù)性考察，穩(wěn)定性考察以及回收率考察，結(jié)果表明，精密度考察的6份樣品平均峰面積RSD值為0.33%，重復(fù)性考察的6份樣品平均峰面積RSD值為0.68%，穩(wěn)定考察在12 h內(nèi)測定RSD值為0.75%，回收率考察的6次測量平均回收率及RSD，分別為101.1%和0.82%。由此說明建立的高效液相色譜法測定吳茱萸次堿含量的檢測分析方法良好。

2.3.4 溶解度測定 利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用高效液相色譜法，分別測定吳茱萸次堿、吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物在水中的溶解度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿在水中不溶，吳茱萸次堿-HP-β-CD物理混合物的溶解度為 2.23 μg/ml，吳茱萸次堿-HP-β-CD 的溶解度為90.40 μg/ml，包合物在水中的溶解度增加明顯。表明通過包合作用，吳茱萸次堿的水溶性得到顯著性的提高。

3 結(jié)論

吳茱萸次堿是屬于難溶于水的天然活性成分，具有開發(fā)成為新型抗高血壓的潛在趨勢。本實(shí)驗(yàn)利用HP-β-CD具有環(huán)形中空的筒狀結(jié)構(gòu)，可以作為主體與其它化合物分子形成超分子結(jié)構(gòu)，從而改變客體的理化性質(zhì)，明顯增加了吳茱萸次堿在水中的溶解度，為吳茱萸次堿的進(jìn)一步開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。常用的包合物制備方法有飽和水溶液法、研磨法、超聲法、冷凍干燥法、噴霧干燥法，液－液法和氣－液法。本文通過超聲法制備獲得吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物，該方法操作簡單，條件易控，具有時間短，速度快，節(jié)省能源，效率高的優(yōu)點(diǎn)，值得推廣使用。

本文采用高效液相色譜法考察了吳茱萸次堿-HP-β-CD包合物的增溶效果，發(fā)現(xiàn)制備的吳茱萸次堿-HP-β-CD 包合物的溶解度為90.40 mg/L，與吳茱萸次堿不溶于水的性質(zhì)比較，表明通過包合作用可明顯提高吳茱萸次堿在水中的溶解度，由此提高了吳茱萸次堿藥物的生物利用度和適用范圍，為吳茱萸次堿制劑的開發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。

［1］ 王翠玲，劉建利，令亞萍.吳茱萸次堿的合成進(jìn)展［J］.有機(jī)化學(xué)，2006，26(10):1437-1443.

［2］ Li JZ，Peng J，Xiao L，et al.Reversal of isoprenaline-induced cardiac remodeling by rutaecarpine via stimulation of calcitonin gene-related peptide production［J］.Can J Physiol Pharmacol，2010，88(10):949-959.

［3］ Wang L，Hu CP，Deng PY，et al.The protective effects of rutaecarpine on gastric mucosa injury in rats［J］.Planta Med，2005，71(5):416-419.

［4］ Ko HC，Wang YH，Liou KT，et al.Anti-inflammatory effects and mechanisms of the ethanol extract of Evodia rutaecarpa and its bioactive components on neutrophils and microglial cells［J］.Eur J Pharmacol，2007，555(2-3):211-217.

［5］ Shin YW，Bae EA，Cai XF，et al.In vitro and in vivo antiallergic effect of fructus of evodia rutaecarpa and its constituents［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(1):197-199.

［6］ Xu Y，Liu Q，Xu Y，et al.Rutaecarpine suppresses atherosclerosis in ApoE-/-mice through upregulating ABCA1 and SR-BI within RCT［J］.J Lipid Res，2014，55(8):1634-1647.

［7］ Li YJ，Zhang F，Gong QH，et al.Rutaecarpine inhibits angiotensin II-induced proliferation in rat vascular smooth muscle cells［J］.Chin J Integr Med.，2014，20(9):682-687.

［8］ Eon TW，Jin CH，Lee SK，et al.Immunosuppressive effects of rutaecarpine in female BALB/c mice［J］.Toxicol Lett，2006，164(2):155-166.

［9］ Zhao N，Li ZL，Li DH，et al.Quinolone and indole alkaloids from the fruits of Euodia rutaecarpa and their cytotoxicity against two human cancer cell lines［J］.Phytochemistry，2015，109:133-139.

［10］ Yi HH，Rang WQ，Deng PY，et al.Protective effects of rutaecarpine in cardiac anaphylactic injury is mediated by CGRP［J］.Planta Med，2004，70(12):1135-1139.

［11］ Yu J，Tan GS，Deng PY，et al.Involvement of CGRP in the inhibitory effect of rutaecarpine on vasoconstriction induced by anaphylaxis in guinea pig［J］.Regul Pept，2005，125(1-3):93-97.

［12］繆菊連，黃照昌.羥丙基-β-環(huán)糊精對人參皂苷Rg1溶解度的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(21):17-19.

［13］楊彩琴，王靜，紀(jì)桂霞.羥丙基-β-環(huán)糊精對雙苯氟嗪包合作用的熱力學(xué)研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2010，22(4):495-498.

［14］張學(xué)農(nóng)，唐麗華，閻雪瑩，等.羥丙基-β-環(huán)糊精對紫杉醇的增溶作用及其分子包合機(jī)制研究［J］.中草藥，2007，38(9):1317-1320.