劉偉 張磊 郭慶東 賀亞龍 費舟

·基礎(chǔ)研究·

大鼠彌漫性軸索損傷后皮層和腦干Homer1a蛋白的變化及意義

劉偉 張磊 郭慶東 賀亞龍 費舟

目的研究側(cè)向旋轉(zhuǎn)致大鼠腦彌漫性軸索損傷后皮層和腦干Homer1a蛋白表達規(guī)律及其意義。方法SD大鼠110只，體重(200±20)g，分為對照組和彌漫性軸索損傷(DAI)組，DAI組應(yīng)用側(cè)向旋轉(zhuǎn)DAI致傷模型，對照組不予以旋轉(zhuǎn)致傷，其余處理同DAI組，分別在傷后10 min，30 min，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h取大鼠皮層和腦干組織進行Homer1a蛋白分子的免疫組織化學(xué)和免疫印跡分析檢測。結(jié)果兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)皮層Homer1a蛋白自傷后30 min起表達，腦干Homer1a自傷后10 min就開始表達，均持續(xù)至72 h，皮層各時間點Homer1a表達均弱于腦干組織，而對照組未見該蛋白陽性表達。結(jié)論大鼠腦彌漫性軸索損傷后Homer1a蛋白的表達在皮層和腦干組織表達程度有顯著性差異，提示DAI后主要以腦干損傷較為嚴(yán)重，Homer1a蛋白分子參與了神經(jīng)元損傷后腦保護過程。

Homer蛋白； 免疫組織化學(xué)； 免疫印跡技術(shù)； 彌漫性軸索損傷

腦彌漫性軸索損傷 (diffuse axonal injury，DAI)在重型顱腦損傷中占28%～42%，死亡率高達42%～62%[1-2]。尸檢肉眼觀察無明顯占位病變，光鏡下可見胼胝體、腦干上端、大腦白質(zhì)等部位廣泛的神經(jīng)軸索腫脹、斷裂并出現(xiàn)軸縮球。故DAI是以腦深部神經(jīng)軸索變化為病理特征的腦損傷，目前已被視為一種獨立的腦損傷類型，但發(fā)病機理尚不完全清楚[3]。Homer蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一組信號調(diào)節(jié)蛋白，它可以特異性的和代謝性谷氨酸受體1a結(jié)合，調(diào)控蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布，在神經(jīng)元損傷中可能發(fā)揮重要作用。其中Homer1a在腦損傷前后發(fā)生明顯變化，而Homer1b/c，Homer2，Homer3表達無明顯變化。認為Homer1a在腦損傷后神經(jīng)元的保護過程中起重要作用[4-5]。本實驗通過大鼠頭顱瞬間側(cè)向旋轉(zhuǎn)致DAI后大腦皮層和腦干Homer1a蛋白的變化對DAI的發(fā)病機制進行研究。

材料和方法

一、材料

健康成年雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量為 (200± 20)g，第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供。各Homer蛋白亞型的多克隆抗體均購自SantaCruz公司。兔血清封閉液，兔抗羊免疫組化試劑盒，3，3-二氨基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)顯色試測盒，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfatcpolyaery lamideSDS-PAGE)低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白及 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鉀苯胺/硝基四唑藍(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine/nitroblue tetrazolium，BCIP/NBT)顯色試測盒購自武漢博士德公司。

二、方法

1.動物分組及模型制作。SD大鼠隨機分為對照組10只，損傷組據(jù)標(biāo)本采集時間又分為10 min，30 min，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h等每組10只。損傷模型采用賀曉生[6]大鼠頭顱瞬間側(cè)向旋轉(zhuǎn)模型，對照組作麻醉后上側(cè)向旋轉(zhuǎn)機器但不致?lián)p傷。

2.取材。各組大鼠至預(yù)定時間后常規(guī)麻醉，每組中隨機取5只行4%多聚甲醛灌注固定后取腦組織常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，待免疫組化檢測。另外5只斷頭取腦，選取皮層，腦干分別提取組織，多去污劑裂解緩沖液于勻漿器內(nèi)裂解勻漿，勻漿液高速離心(12 000 r/min，15 min)后取上清液冷凍保存，待分別進行Homer1a，Homer1 b/c蛋白免疫印記檢測。

3.統(tǒng)計學(xué)分析 使用灰度比較軟件比較蛋白免疫印記結(jié)果，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，以統(tǒng)計軟件SPSS12.0做雙例t檢驗，以P＜0.05作為差異顯著水準(zhǔn)。

結(jié)果

免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)大鼠皮層腦組織和腦干組織中有Homer1a及Homer1b/c蛋白分子的陽性表達，其中皮層組織Homer1a分子于DAI后30 min起出現(xiàn)，持續(xù)傷后72 h，腦干組織Homer1a分子于DAI后10 min起出現(xiàn)，持續(xù)傷后72 h，而Homer1b/c分子于對照組和DAI組個時間點均可見陽性表達。

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Homer1a和Homer1b/c蛋白分子陽性染色結(jié)果在皮層和腦干均有分布，其信號均為棕黃色，兩者在胞核均未見陽性結(jié)果(圖1)。 DAI后Homer1a分子在皮層較腦干出現(xiàn)較晚，對照組未見陽性表達Homer1a。Homer1b/c分子在對照組和DAI組均可見陽性表達。

圖1 DAI大鼠傷后腦干Homer1a陽性神經(jīng)元的表達(SABC法，×200)

討論

Homer蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一組信號調(diào)節(jié)蛋白，它可以特異性的和代謝性谷氨酸受體1a結(jié)合，調(diào)控蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布，在神經(jīng)元損傷中可能發(fā)揮重要作用[7]。Homer蛋白家族目前已發(fā)現(xiàn)homer1、homer2、homer3，3類共 17種蛋白。其中 Homer1 mRNA剪切后表達產(chǎn)生1a、1b、1c3種蛋白[8]。前期實驗研究體外培養(yǎng)神經(jīng)元機械損傷后homer1a表達明顯升高，而homer1b/c，2a/b和3表達無明顯變化[4-5]。Homer1a分子屬于短Homer蛋白，N-末端包含一個EVH1同源結(jié)構(gòu)域，可以和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluRs)及三磷酸肌醇受體 (inositol trisphosphate receptor，IP3R)相結(jié)合。Homer1b/c屬于長Homer蛋白，N-末端也含有EVH1同源結(jié)構(gòu)域，其C-末端還有一個長的氨基酸鏈形成卷曲螺旋二級結(jié)構(gòu)，可以形成同源或異源性的Homer蛋白二聚體[9]。大鼠彌漫性腦損傷后皮層內(nèi)mGluR1a變化最為明顯，是加重神經(jīng)元損傷的主導(dǎo)因素。而該受體在沒有激動劑存在下仍可以介導(dǎo)細胞內(nèi)IP3的升高及Ca2+依賴的 K+通道的開放。Homer1b/c的 CC螺旋結(jié)構(gòu)形成多具體，連接mGluRs和IP3R分子，使刺激信號很快通過這種連接激活I(lǐng)P3R引起細胞內(nèi)Ca2+的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞進一步損傷。而Homer1a表達受多種刺激因素調(diào)控，他可以選擇性阻斷Homer1b/c與mGluRs的結(jié)合延緩IP3R分子的激活，減少細胞內(nèi)Ca2+的釋放[10]。

本實驗發(fā)現(xiàn)DAI后Homer1a在大鼠皮層30 min開始出現(xiàn)表達，至24 h達到高峰，72 h仍有表達。在腦干組織10 min即出現(xiàn)表達，12 h達到高峰，72 h仍有表達。Homer1a在大鼠皮層組織表達較腦干出現(xiàn)稍晚，且在各時間點較腦干表達低。DAI損傷范圍的分布與物種間顱腦解剖結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，靈長類動物有堅硬的大腦鐮，因而頭顱加速減速運動時鐮下胼胝體極易受到損傷[3]。Ross等[11]采用幼豬DAI模型軸索損傷主要發(fā)生在腦白質(zhì)淺層，Povlishock[12]發(fā)現(xiàn)小動物軸索損傷好發(fā)于腦干。本實驗采用Xiao-Sheng等[6]報道大鼠腦彌漫性軸索損傷致傷裝置，大鼠頭顱于3 ms內(nèi)在冠狀面旋轉(zhuǎn)90°，腦部角速度＞767 rad/s，角加速度＞1.87×103rad/s2，大鼠DAI損傷在病理上集中在腦干內(nèi)。損傷后在腦干可發(fā)現(xiàn)大量軸索腫脹和軸索球。在傷后6～72 h觀察發(fā)現(xiàn)，同一時間點軸縮球密度在延髓、中腦、胼胝體呈遞減趨勢[13-14]。Homer1a蛋白在大鼠皮層和腦干的表達變化也說明了DAI損傷較早和主要發(fā)生在大腦中線位置。

據(jù)報道頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)可致神經(jīng)軸索損傷，引起腦干水腫，而軸索內(nèi)Ca2+超載是軸索損傷的重要中介因素[15]。經(jīng)過Ca2+細胞化學(xué)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)DAI后軸漿內(nèi)細胞器周邊聚集、腫脹、在分離的髓鞘板層上鈣顆粒沉積、鈣分布越多處髓鞘破壞越重、軸漿內(nèi)也見鈣顆粒。雖然以往報道Homer1a可以阻斷Homer1b/c與mGluRs的結(jié)合延緩IP5R分子的激活減少細胞內(nèi)Ca2+的釋放，但是在DAI的自然病程中作為即早基因表達產(chǎn)物的Homer1a不足以阻斷Ca2+通道的開放，減輕神經(jīng)損傷。增加體內(nèi)Homer1a 與mGluRs結(jié)合延緩IP3R分子的激活，減少細胞內(nèi)Ca2+的釋放，為減輕神經(jīng)軸索損傷腦干水腫提供新的治療方案。

[1] Lobato RD,Alen JF,Perez-Nu?ez A,et al.Value of serial CT scanning and intracranial pressure monitoring for detecting new intracranial mass effect in severe head injury patients showing lesions type I-II in the initial CT scan[J].Neurocirugia(Astur), 2005,16(3)：217-234.

[2] 趙孟堯,過宗南,劉建民,等.腦彌漫軸索傷[J].中華神經(jīng)外科雜志,1991,7(2)：93-95.

[3] Maxwell WL,Povlishock JT,Graham DL.A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury：a review[J].J Neurotrauma,1997, 14(7)：419-440.

[4] Morioka R,Kato A,Fueta Y,et al.Expression of vesl-1S/ homer1a,a gene associated with long-term potentiation,in the brain of the epileptic EI mouse[J].Neurosci Lett,2001,313(1-2)：99-101.

[5] 費舟,章翔,黃衛(wèi)東,等.神經(jīng)元機械性損傷后Homer蛋白表達及意義[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2005,4(2)：133-136.

[6] Xiao-Sheng H,Sheng-Yu Y,Xiang Z,et al.Diffuse axonal injury due to lateral head rotation in a rat model[J].J Neurosurg,2000, 93(4)：626-633.

[7] Brakeman PR,Lanahan AA,Obrien R,et al.Homer：a protein thatselectively bindsmetabotropic glutamate receptors[J]. Nature,1997,386(6622)：284-288.

[8] Hwang SY,Wei J,Westhoff JH,et al.Differential functional interaction of two Vesl/Homer protein isoforms with ryanodine receptor type1：anovel mechanism for control of intracellular calcium signaling[J].Cell Calcium,2003,34(2)：177-184.

[9] Kato A,Ozawa F,Saitoh Y,et al.Novel members of the Vesl/ Homer family of PDZ proteins that bind metabotropic glutamate receptors[J].J Biol Chem,1998,273(37)：23969-23975.

[10] Abe H,Misaka T,Tateyama M,et al.Effects of coexpression with Homer isoforms on the function of metabotropic glutamate receptor 1alpha[J].Mol Cell Neurosci,2003,23(2)：157-168.

[11] Ross DT,Meaney DF,Sabol MK,et al.Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine[J].Exp Neurol,1994,126(2)：291-299.

[12] Povlishock JT.Pathobiology of traumatically induced axonal injury in animals and man[J].Ann Emerg Med,1993,22(6)：980-986.

[13] 賀曉生,易聲禹,章翔,等.大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)致腦彌漫軸索損傷的形態(tài)學(xué)觀察與機理探討[J].中華神經(jīng)外科雜志,1998, 14(1)：8.

[14] Xiao-Sheng H,Xiang Z,Zhou F,et al.Calcium overloading in traumatic axonal injury by lateral head rotation：a morphological evidence in rat model[J].J Clin Neurosci,2004,11(4)：402-407.

[15] Huang WD,Fei Z,Zhang X.Traumatic injury induced homer-1a gene expression in cultured cortical neurons of rat[J].Neurosci Lett,2005,389(1)：46-50.

Expression and significance of Homer1a after brain diffuse axonal injury in rat pallium andbrainstem

Liu Wei,Zhang Lei,Guo Qingdong,He Yalong,Fei Zhou.Institute of Neurosurgery,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi’an 710032,China

Fei Zhou,Email:feizhou123@163.com

ObjectiveTo study the expression of Homer1a in brain diffuse axonal injury in rat pallium and brainstem.MethodsNinety SD rats,with weight of(200±20)g,were randomized to normal and DAI group.The rat DAI models were produced in DAI group and the normal group was treated in the same way given to the DAI group except for“free rotating”attack.The rats’pallium and brainsteam were detected for Homer1a by immunoblotting and immunohistochemistry after injury at 10 min,30 min,1 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h respectively.ResultsThe Homer1a was positive in the pallium after injury from 30 min to 72 h.The Homer1a was positive in the brainstem after injury from 10 min to 72 h.The expression of Homer1a in pallium was weaker than in brainstem at every time we detected.Homer1a was no expression in normal group.ConclusionThe expression of Homer1a in pallium and in brainsteam was significant difference,indicates that the pathognomonic of DAI was brain stem inury.The Homer1a maybe involved in the brain protection after neuronal injury.

Homer protein;Immunohistochemistry; Immunoblotting;Diffuse axonal injury

2015-06-11)

(本文編輯:楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.06.007

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科

費舟，Email：feizhou123@163.com

劉偉,張磊,郭慶東,等.大鼠彌漫性軸索損傷后皮層和腦干Homer1a蛋白的變化及意義[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志, 2015,1(6)：343-345.