於紹龍，劉丹平，趙 輝，齊 鑫，張解元，李 諶

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)外科，遼寧 錦州121001)

選擇優(yōu)秀的種子細(xì)胞是骨組織工程首要解決的問題。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)具有較強(qiáng)的多向分化能力，在一定條件下可分化為骨或軟骨等細(xì)胞，為骨組織工程應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞[1]。骨形態(tài)形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)是唯一能單獨(dú)誘導(dǎo)骨組織形成的生長因子[2]。將BMP2與BMSCs 聯(lián)合應(yīng)用的方法，在骨組織工程領(lǐng)域取得了一定的成功，但在較大面積的骨缺損時(shí)，植入物可因缺少充足的血供而發(fā)生壞死[3]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞直接參與血管形成[4]，但EPCs 在損傷局部數(shù)量有限，不足以用于大面積缺血缺損的修復(fù)。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)在組織低氧的條件下表達(dá)增加，可以募集和趨化EPCs至缺損處，其本身也可直接誘導(dǎo)血管生成[5-6]。但野生型HIF-1α 在常氧環(huán)境中極易降解失活。前期使用分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了能在常氧條件下表達(dá)的突變體，記作HIF1αmu[7-8]，使HIF1α 能夠在低氧及常氧條件下持續(xù)高水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)將EPCs 及HIF1α 因子與BMSCs 及BMP2 聯(lián)合應(yīng)用，旨在探討表達(dá)HIF1αmu的EPCs 能否使BMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs成骨及成血管能力增加。

1 材料與方法

1.1 材料

3月齡清潔級(jí)雄性新西蘭大白兔1只，2.5 kg[遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào):SCXK(遼)2008-0007]。腺病毒載體Adv-BMP2和Adv-HIF1αmu由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，Adv-HIF-1αmu由遼寧醫(yī)學(xué)院劉丹平等構(gòu)建。DMEM 培養(yǎng)基、EDTA-胰蛋白酶(Gibco 公司);10%胎牛血清、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、青霉素和淋巴細(xì)胞分離液和M199 培養(yǎng)液(Hyclone 公司);VEGF、bFGF、ECGS(內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑)(Peprotech 公司);人纖維連接蛋白(Chemicon 公司);抗BMP-2 單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)、FITC 標(biāo)記的荊豆凝(FITC-UEA-I)、DiI 標(biāo)記的乙酰低密度脂蛋白(DiIacLDL)、抗CD45-FITC、抗CD105-FITC、抗CD34-PE抗體、兔IgG1-FITC、IgG1-PE 和ALP 試劑盒(Sigma公司);抗HIF-1α 單克隆抗體(Novus 公司);所有PCR引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs 分離、培養(yǎng)及鑒定:氯胺酮麻醉后，無菌條件下取出兔四肢骨，去除骨周圍軟組織，用DMEM 反復(fù)沖洗股骨及脛骨骨髓腔，收集骨髓液，將其緩慢注入加有淋巴細(xì)胞分離液的離心管內(nèi)，2 000 r/min 離心20 min，吸取白色膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層接種于DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，每周換液3次。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)到90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶－0.02% EDTA 消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞至1×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶中，每3 天換液1次，傳至第3代備用。培養(yǎng)的兔BMSCs 采用如下方法進(jìn)行鑒定:1)使用倒置相差顯微鏡于培養(yǎng)的第2天，第6天，第11天觀察細(xì)胞的形態(tài)特征以及生長情況。2)取第3代BMSCs，待細(xì)胞長到近90%匯合時(shí)，以2.5 g/L 胰蛋白酶消化3～5 min，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，分別取1×106個(gè)BMSCs，用抗CD34-PE、CD45-FITC、CD105-FITC 抗體，避光孵育25 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析BMSCs表面標(biāo)志，細(xì)胞以同型的IgG1-PE 或IgG1-FITC 染色作為陰性對照。

1.2.2 兔骨髓EPCs 分離、培養(yǎng)及鑒定:無菌條件下取出兔四肢長骨，使用PBS 沖出骨髓，密度梯度離心法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，PBS 清洗2次，M199培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，沖洗整個(gè)培養(yǎng)瓶，搜集未貼壁的細(xì)胞，離心并重懸在M199 培養(yǎng)基中，以1×106/mL 將細(xì)胞接種在預(yù)先包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后首次換液，去除其中不貼壁細(xì)胞，后每隔3 d換液1次，去除懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)的兔骨髓源性EPCs 采用如下方法進(jìn)行鑒定:1)培養(yǎng)后2和9 d 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，14 d 再次觀察其形態(tài)特征。2)免疫熒光雙重染色:取培養(yǎng)第的2代細(xì)胞，加入5 mL 含DIL-ac-LDL(10μg/mL)的孵育液，37℃孵育4 h，PBS 沖洗2次，2%多聚甲醛于4℃固定10 min，PBS 漂洗3次，加入10 μg/mL的FITCUEA-1，在室溫條件下避光孵育1 h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 MTT法確定EPCs與BMSCs 混合細(xì)胞培養(yǎng)比例

將第3代EPCs 和BMSCs 分別以1∶2、1∶1 和2∶1比例混合，以1×104個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96孔板放置于37℃溫箱培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)后1～7 d的細(xì)胞進(jìn)行檢測。將MTT 溶液以20 μL/每孔加入各細(xì)胞孔內(nèi)，繼續(xù)37℃孵育4 h后棄上清終止培養(yǎng)，將DMSO 以150 μL/孔加入孔板，振蕩器振蕩5 min，酶標(biāo)儀在580 nm 波長下測定各孔光吸收值(A value)，記錄分析結(jié)果。

1.4 以最佳轉(zhuǎn)染指數(shù)分別轉(zhuǎn)染Adv-BMP2 及Adv-HIF1αmu到BMSCs 和EPCs

依據(jù)該實(shí)驗(yàn)之前的研究結(jié)果[7-8]，選取培養(yǎng)的第3代BMSCs 及EPCs 為種子細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種至3 塊6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后吸去上清，MOI值為100 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入2 mL 無血清培養(yǎng)基，37℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h，每孔再補(bǔ)充2 mL 含10% FBS的M199 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d。倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)。

1.5 Western Blot檢測BMP2 及HIF-1α表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后3 d的Adv-BMP-2 BMSCs、Adv-HIF1αmu-EPCs、及未轉(zhuǎn)染的BMSCs、EPCs 提取各組細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白含量，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，封閉，使用Tween-20 PBS 稀釋一抗(抗BMP-2 及抗HIF-1α 單克隆抗體)，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊IgG)與濾膜共溫育，DAB 顯色。用凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶和內(nèi)參照(β-actin)，測定吸光度(A)值。各組重復(fù)測量3次。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及成骨和成血管相關(guān)檢測

1.6.1 實(shí)驗(yàn)分組及堿性磷酸酶(ALP)活性測定:實(shí)驗(yàn)共分6 組:A組(單純BMSCs);B組(Adv-BMP-2 BMSCs);C組(BMSCs+EPCs);D組(Adv-BMP-2 BMSCs+EPCs);E組(BMSCs+Adv-HIF1αmu-EPCs);F組(Adv-BMP-2 BMSCs+Adv-HIF1αmu-EPCs)。各混合細(xì)胞培養(yǎng)組(C～F組)細(xì)胞混合比例為MTT法(步驟同1.3)所確定的最適混合比例。各實(shí)驗(yàn)組BMSCs 及EPCs的細(xì)胞均調(diào)整為1×105/mL。將各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用PBS 沖洗1次，加入500 μL，0.1%Triton X-100，4℃裂解過夜，收集裂解液并離心，取上清液20 μL，置于96孔板中，并加入100 μL 反應(yīng)液(包含10 mmol/L p-nitrophenyl phosphate)，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行反應(yīng)，15 min后，加入0.2 mol/L NaOH 80 μL 終止反應(yīng)，405 nm 下測量吸光度。ALP活性以每升每分鐘產(chǎn)生p-nitrophenol(μmol/minoL)的量表示。

1.6.2 定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)測定成骨和成血管相關(guān)基因的mRNA的表達(dá):用Trizol 法提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后按設(shè)定的PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的特異性引物包括成骨相關(guān)基因:osteocalcin(OCN)，Collagen type 1，alpha 1(Col1α1)，BMP2，Runx2以及成血管相關(guān)基因:VEGF，vWF，SDF1，cdh5。根據(jù)Genbank 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，PCR 反應(yīng)條件為94℃，1 min;95℃，30 s;58℃，40 s，共進(jìn)行35個(gè)周期。PCR 結(jié)果采用相對表達(dá)量(2－△△ct)進(jìn)行分析，引物序列如表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。

表1 定量反轉(zhuǎn)錄PCR引物序列Table1 Primers for q-RT PCR

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定

細(xì)胞接種后24～48 h，出現(xiàn)少量梭形細(xì)胞貼壁生長，吸除未貼壁細(xì)胞，6 d后細(xì)胞生長逐漸加速，呈長梭形，可見集落形成，至11 d 90%以上細(xì)胞匯合。傳代后的細(xì)胞形態(tài)更加單一，細(xì)胞鋪滿瓶底，排列仍有規(guī)則的方向性(圖1)。

BMSCs表面標(biāo)記CD34、CD45 和CD105 陽性率分別為10.4%、5.75%和95.8%(圖2)。

圖1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)Fig1 Cellular morphology of BMSCs(×100)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)記Fig2 BMSCs surface markers were determined by the flow cytometry

2.2 兔EPCs的鑒定

EPCs 于接種后48 h 開始貼壁，可見有梭形或不規(guī)則三角形細(xì)胞貼附于培養(yǎng)皿底部。培養(yǎng)第4 天換液后可見細(xì)胞集落形成，成漩渦狀排列。第7～9天細(xì)胞的形態(tài)開始由長梭型變成多角形并逐漸匯合為片狀，第10～15 天可見EPCs 呈“鋪路石”樣特異性表現(xiàn)(圖3)。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)Fig3 Morphology of EPCs(×100)

FITC 標(biāo)記的UEA-1 為綠色熒光，Dil 標(biāo)記的ac-LDL 為紅色熒光，出現(xiàn)的雙熒光陽性細(xì)胞即為EPCs細(xì)胞(圖4)。

圖4 內(nèi)皮祖細(xì)胞免疫熒光檢測Fig4 Immunofluorescence detection of EPCs(×100)

2.3 MTT法檢測不同比例BMSCs/EPCs 混合培養(yǎng)增殖能力

自第2 天開始BMSCs/EPCs 為1∶1 混合培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力高于1∶2和2∶1 混合培養(yǎng)組的增殖能力(P＜0.05)。故本實(shí)驗(yàn)將1∶1 作為兩種細(xì)胞的最佳混合比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖5)。

圖5 不同比例BMSCs/EPCs增殖曲線Fig5 The proliferative curve of different ratio of BMSCs and EPCs

2.4 腺病毒轉(zhuǎn)染效果觀察

轉(zhuǎn)染72 h，BMSCs 和EPCs 組在MOI值為100時(shí)轉(zhuǎn)染的效果，無明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(圖6)。

圖6 轉(zhuǎn)染后倒置顯微鏡下免疫熒光觀察Fig6 Transfection result observed by the immunofluorescence microscopy(×100)

2.5 Western blot檢測BMP-2和HIF-1α蛋白表達(dá)

Adv-BMP-2 BMSCs 和BMSCs組均可見BMP-2蛋白表達(dá)，且其表達(dá)量高于EPCs 或Adv-HIF-1αmu-EPCs組(P＜0.05)。Adv-HIF-1αmu-EPCs 組可見HIF-1α蛋白表達(dá)，且其表達(dá)量明顯高于其他3組(P＜0.05)(圖7，8)。

圖7 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后BMP-2和HIF-1α的蛋白表達(dá)Fig7 BMP-2 protein and HIF-1α protein expression by Western blot at 3 days after transfected

圖8 BMP-2和HIF-1α的蛋白表達(dá)情況Fig8 BMP-2 and HIF-1α protein expression at 3 days

2.6 ALP生物活性測定

A組、B組、C組及E組的ALP濃度低于F組(P＜0.05)。D組的ALP濃度低于F組(P＜0.05)(表2)。

表2 轉(zhuǎn)染后各組ALP 活性測定Table2 ALP activity of different groups after transfected(±s，n=6)

表2 轉(zhuǎn)染后各組ALP 活性測定Table2 ALP activity of different groups after transfected(±s，n=6)

*P＜0.05 compared with F group;#P＜0.05 compared with F group.

group ALP Activity (μmol/minoL)A 5.42±0.09*B 8.36±0.12*C 9.35±0.11*D 13.37±0.19#E 11.27±0.14*F 14.51±0.23

2.7 Adv-HIF1αmu-EPCs 對Adv-BMP-2 BMSCs成血管及成骨相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

F組成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平高于其他組(P＜0.05)。和A組相比，C組成骨基因表達(dá)水平明顯增高(P＜0.05)(表3)。在含有EPCs的各組成血管基因表達(dá)高于不含有EPCs組(P＜0.05)，并且在含有EPCs的4 組中，轉(zhuǎn)染HIF-1αmu組的成血管基因表達(dá)要高于其他2組(P＜0.05)(表4)。

表3 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)Table3 Analysis of osteoblast marker genes expression detected by qRT-PCR(±s，n=3)

表3 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達(dá)Table3 Analysis of osteoblast marker genes expression detected by qRT-PCR(±s，n=3)

*P＜0.05 compared with F group;#P＜0.05 compared with A group.

group OCN Col ⅠBMP2 Runx2 A 1.00±0.14* 1.00±0.11* 1.00±0.12* 1.00±0.09*B 4.12±0.51* 1.55±0.13* 2.95±0.26* 2.43±0.18*C 3.63±0.32* # 1.37±0.21* # 1.35±0.18* # 2.12±0.14* #D 5.71±1.23* 2.35±0.43* 4.52±0.76* 4.23±0.52*E 4.56±1.02* 1.62±0.25* 2.14±0.42* 2.14±0.42*F 7.18±1.87 2.51±0.14 6.53±1.09 5.53±0.71

表4 qRT-PCR檢測成血管相關(guān)基因表達(dá)Table4 Analysis of angiogenic marker genes expression detected by qRT-PCR (±s，n=3)

表4 qRT-PCR檢測成血管相關(guān)基因表達(dá)Table4 Analysis of angiogenic marker genes expression detected by qRT-PCR (±s，n=3)

*P＜0.05 compared with E and F group.

group VEGF vWF SDF1 cdh5 A 1.00±0.15* 1.00±0.12* 1.00±0.08* 1.00±0.11*B 1.16±0.43* 1.21±0.19* 1.12±0.24* 1.05±0.18*C 1.72±0.28* 1.85±0.21* 1.68±0.13* 1.74±0.15*D 1.75±0.23* 1.88±0.54* 1.17±0.36* 1.77±0.42*E 2.05±0.32 2.41±0.25 2.15±0.32 2.32±0.22 F 2.26±0.57 2.55±0.17 2.46±0.09 2.45±0.21

3 討論

近年來，將BMSCs 移植到缺損部位完成骨組織的修復(fù)和再生成為骨組織工程研究熱點(diǎn)[9]。BMSCs來源充足、對供區(qū)損傷小、易于獲取、體外擴(kuò)增迅速[10]。EPCs 能夠定向分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管的新生[11]。本實(shí)驗(yàn)中，BMSCs與EPCs 共培養(yǎng)時(shí)兩種細(xì)胞生長良好，1∶1 混合培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的增殖能力高于1∶2 及2∶1 混合培養(yǎng)增殖能力。

隨著基因技術(shù)的發(fā)展，大部分研究采用攜帶BMP-2 基因來轉(zhuǎn)染BMSCs，促使其向成骨細(xì)胞分化，用于修復(fù)骨缺損[12]。但單一使用BMP-2 基因，可能會(huì)導(dǎo)致新生骨區(qū)無法產(chǎn)生足量的毛細(xì)血管，最終導(dǎo)致骨折延遲愈合、不愈合。HIF-1α 為DNA 結(jié)合蛋白，能促進(jìn)毛細(xì)血管生成[13]。同時(shí)HIF-1α 還在缺氧環(huán)境中維持成骨細(xì)胞的代謝，發(fā)揮成骨效應(yīng)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)利用之前構(gòu)建[7-8]的單表達(dá)載體Adv-BMP2和 Adv-HIF1αmu分別轉(zhuǎn) 染 BMSCs 及EPCs。在常氧條件下BMP2 在Adv-BMP-2 BMSCs組和BMSCs組表達(dá)，由于EPCs 組表達(dá)的HIF1α 在常氧條件下立刻被分解，故HIF1α 僅在Adv-HIF1αmu-EPCs 組穩(wěn)定表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，C組ALP 活性及成骨、成血管基因表達(dá)均高于A組，并且與B組相比，成骨指標(biāo)并不遜色且成血管指標(biāo)均高于B組。推測當(dāng)BMSCs與EPCs 建立共培養(yǎng)體系時(shí)，這兩種細(xì)胞能通過自分泌或旁分泌的方式進(jìn)行通信，通過細(xì)胞間的接觸或細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，顯示出更好的成骨及成血管特性。同時(shí)結(jié)果顯示F組ALP 活性、成骨和成血管相關(guān)基因表達(dá)均高于其他組，表明表達(dá)HIF1αmu-EPCs 不僅可以通過細(xì)胞間的相互作用上調(diào)Adv-BMP2轉(zhuǎn)染BMSCs成骨和成血管的能力，也可以通過持續(xù)的HIF1α 基因的表達(dá)增加Adv-BMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs 這些潛能，兩者相互促進(jìn)，相輔相成。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明在體外常氧條件下，Adv-HIF1αmu-EPCs 能夠增強(qiáng)Adv-BMP-2 BMSCs的成骨以及成血管潛力，為骨組織工程以及臨床治療骨缺損及骨壞死疾病提供了新的思路。

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