張柱霞，孫明英，楊 潔，姜樹原，石 蕊，閆少春*，邵 國，2*

(1.包頭醫(yī)學院 生物醫(yī)學研究中心 基礎醫(yī)學部，內蒙古 包頭014010;2.首都醫(yī)科大學附屬宣武醫(yī)學院低氧醫(yī)學研究所，北京100053)

哺乳動物細胞胞嘧啶的甲基化是細胞分裂后的細胞記憶形成的至關重要的表觀遺傳學事件，而到目前為止，具有催化活性的C5 甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)共有3種，DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B。DNMT1的主要作用是在DNA 復制中催化新合成的DNA 子鏈(半甲基化DNA)的甲基化，從而維持基因組DNA甲基化的模式，而DNMT3A 和3B的主要作用是催化DNA 建立新的DNA甲基化模式。維持型DNA甲基轉移酶(DNMT1)和從頭合成型甲基轉移酶(DNMT3A 和DNMT3B)功能并非涇渭分明，它們之間協同作用來對DNA 進行修飾[1]。

到目前，發(fā)現人類DNMT3B 由于剪接/轉錄起始點的差異造成有近40種異構體[2-5]，DNMT3B1是最大的DNMT3B，其cDNA是4 195 bp，編碼859個氨基酸[2]。其余的異構體與DNMT3B1 相比可以大致分為4類:1)DNMT3B3-5 和DNMT3B7 缺少DNMT3B的C 末端;2)ΔDNMT3B 家族缺少DNMT3B的N 末端[3-5];3)DNMT3BΔ5 和DNMT3BΔ(4+5)缺少DNMT3B的靠近PWWP 結構域的一些氨基酸序列[6];4)DNMT3B2和DNMT3B6 保留了幾乎與DNMT3B1 相同的序列[7]。

雖然人們對DNMT3B異構體進行了部分研究，但其功能尚不十分明了，本研究通過克隆人DNMT3B 典型6種異構體并建立真核表達載體以及其穩(wěn)定過表達細胞株，對DNMT3B 典型6種異構體進行初步系統研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

HCT116細胞(上海細胞所);293A細胞(北京協和醫(yī)學院基礎學院細胞中心);Trizol(Gibcobrl 公司);反轉錄試劑盒(Invitrogen 公司);限制性內切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ(Takara 公司);Expand High Fidelity PCR System 及rapid ligation Kit (Roche 公司);DNA 回收試劑盒(Qiagen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取，RT-PCR 及PCR:利用Trizol 試劑從HCT116細胞中分離總RNA，按照反轉錄試劑盒得到cDNA，利用Expand High Fidelity PCR System進行擴增，所有異構體的正向引物序列為CGGGATCCAAGGGAGACACCAGGCATCTC，DNMT3B1、DNMT3B2和DNMT3B3的反向引物序列為5'-GCGA ATTCTCACACCTCCTGGGTCCTGGCTC-3'，DNMT3-B4、DNMT3B5 和DNMT3B7的反向引物序列分別為5'-GCGAATTCCTGTTCATCCCGGGTAGG-3'、5'-GCGA ATTCCATGCAAAGTAGTCCTTC-3'和5'-GCGAATTCATATGCCTGGGTACCAGC-3'，其中GGATCC 為BamHⅠ酶切位點和GAATTC 為EcoR Ⅰ酶切位點。擴增條件為94℃變性5 min;94℃、30 s，56℃、60 s，72℃、300 s，30個循環(huán);72℃延伸8 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR 產物，將大小正確的擴增產物用Qiagen PCR 產物回收試劑盒進行回收。

1.2.2 pCMV-DNMT3B異構體真核表達載體的構建及鑒定:BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制性酶分別酶切回收的DNMT3B異構體的片段及pCMV-2B 載體，將酶切的載體和異構體片段用PCR 產物純化試劑盒純化后用rapid ligation kit 進行連接。將DNMT3B異構體的連接產物轉化感受態(tài)細菌DH5α，將轉化后的細菌涂在含有Amp的平板上過夜后挑取單個克隆，擴大培養(yǎng)利用質粒提取試劑盒提取質粒。將提取的重組質粒分別用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切。將酶切鑒定正確的重組質粒送上海生物工程公司進行測序。

1.2.3 穩(wěn)定表達DNMT 異構體的細胞株的建立轉染:人胚腎293A細胞培養(yǎng)于含10% 新生牛血清RPMI1640 培養(yǎng)基的6孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞匯合至70%～80%左右時，使用FUGENE HD 試劑將6種DNMT3B 重組質粒轉染293A細胞，同時轉染空質粒pCMV-2B 作為對照。轉染2 d后將培養(yǎng)基中加入700 μmol/L的G418 對細胞篩選，10 d后將濾紙用胰蛋白酶浸濕后覆蓋在單克隆上，消化后再把濾紙上的細胞洗脫在96孔板里培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)后利用real-time PCR 選取高表達細胞株即為穩(wěn)定表達異構體的克隆株。

利用real-time PCR 和Western blot 技術[7]對穩(wěn)定表達異構體的克隆株在mRNA 和蛋白水平上進行鑒定。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力:各種過表達DNMT3B表達異構體的細胞接種于96孔板(5×103細胞/孔)，培養(yǎng)24 h后開始檢測，連續(xù)檢測4 d，每天隨機選3個孔加入20 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)3 h，去上清后加入150 μL DMSO 振蕩10 min后使用酶標儀檢測490 nm 波長處的吸光度值(A)，以培養(yǎng)天數(D)為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

1.3 統計學分析

用SPSS10.0 數據統計軟件ANOVA 和Tukey對組間數據進行處理和分析，數值以均值±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 6種DNMT3B異構體重組質粒的構建及鑒定

6種DNMT3B異構體瓊脂糖凝膠電泳鑒定為1.1 kb～2.7 kb 大小的異構體片段和4.3 kb的pCMV-2B載體骨架(圖1)。其序列與GenBank 登記的人DNMT3B異構體序列相同。

2.2 穩(wěn)定過表達DNMT3B異構體細胞系的建立

G418 篩選得到高表達DNMT3B異構體的細胞株，其在mRNA 及蛋白水平上都表達升高(圖2，3)。

圖1 質粒PCMV-3B1、3B2、3B3、3B4、3B5 和3B7的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切電泳圖Fig1 Electrophoresis of recombination plasmids of DNMT3B isoforms digested by EcoR Ⅰand BamH Ⅰin agarose gel

圖2 穩(wěn)定轉染DNMT3B異構體細胞異構體mRNA相對轉染空質粒細胞異構體mRNA倍數Fig2 Relative abundance DNMT3B mRNA in stable over-expression DNMT3B isoform cell line to in control cell line(n=3)

圖3 Western 檢測DNMT 3B1、2、3、4、5、7 及空PCMV 在293A細胞中蛋白的表達Fig3 Western blot analysis of the over-expression protein in 293A cell line which transfected with DNMT 3B1，2，3，4，5，7 and pCMV-vector

2.3 穩(wěn)定過表達DNMT3B異構體對293A細胞增殖的影響

將過表達DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5 和DNMT3B7 以及空載體的細胞培養(yǎng)于96孔板后4天時間內，第4 天實驗組和對照組的細胞增殖情況見表1，第4 天293A-DNMT3B7-1 和293A-DNMT3B7-2的A值分別是293A-vector的A值的48.43% 和58.49%;293A-DNMT3B4-1 和293ADNMT3B4-2的A值分別是293A-vector的A值的58.92% 和68.83%;293A-DNMT3B3-1 和293A-DNMT3B3-2的A值分別是293A-vector的A值的60.03% 和62.03% (P＜0.01)(圖4)。

表1 MTT法測定過表達DNMT3B異構體第4天細胞數量(490 nm)Table1 The amount of cells which over-expression DNMT3B isoform on the 4th day by MTT method(490 nm)

圖4 MTT法分析DNMT3B異構體過表達對293A細胞增殖的影響Fig4 MTT analysis of the effect of over-expression DNMT3B isoform on the proliferation of 293A

3 討論

剪接/轉錄起始點的差異造成了DNMT3B 有近40種異構體或拼接體[2-5]。典型的DNMT3B的異構體與DNMT1類似或缺少C 末端的，由于C 末端有甲基轉移酶的結構域，其中結構域Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ為保守結構域，這些結構域對于甲基轉移酶活性是必需的。DNMT3B3 缺少結構域Ⅷ;DNMT3B4缺少結構域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B5 在結構域缺Ⅵ之后氨基酸序列發(fā)生變化，也缺少保守結構域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B7 終止于內含子10，其缺少C端催化序列[8-9]，因而推測這4種都無甲基轉移酶活性。

將克隆的6種異構體轉入293A細胞觀測其對細胞生長的影響，結果顯示穩(wěn)定過表達DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了細胞的增殖速度。有研究報道分離DNMT3A 與DNMT3B 并檢測其甲基轉移酶活性，發(fā)現DNMT3A 與DNMT3B 甲基轉移酶活性較其他種類的甲基轉移酶活性低很多，而將兩者混合的活力則比二者單獨測總和高40%。因此，在生物體內兩種甲基轉移酶可能通過蛋白-蛋白相互作用來發(fā)揮其生物學作用，推斷異構體不影響兩者相互作用[10]。同時，無活性的異構體DNMT3B3和DNMT3B4 可以結合并調節(jié)有催化活性的DNMT3A 和DNMT3B 分子的催化活力[11]。因而當過表達沒有活性的DNMT3B的異構體則可能干擾有活性的DNMT3B的異構體與DNMT3A的相互作用而影響DNA甲基化，而DNA甲基化變化則很可能對于細胞周期產生影響。結果顯示DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了細胞增殖速度可能是緣于此。有趣的是DNMT3B5 同DNMT3B7 等一樣是無甲基轉移酶活力的異構體，但過表達DNMT3B5 對細胞的增殖速度并沒有產生明顯的影響。不同的異構體在細胞核中的定位不同，其生物學功能可能有差異[6]。因此無活性的DNMT3B5 可能由于細胞定位的差異不影響有催化活力的DNMT3A 和DNMT3B，所以過表達不影響其細胞增殖。

本文克隆并構建了6種DNMT3B異構體真核表達載體，將6種異構體穩(wěn)定表達于293A細胞中并初步研究了其對細胞生長的影響。DNMT3B的異構體由于其有無甲基轉移酶活力而對細胞的增殖產生了差異，但無轉移酶活力的DNMT3B5 與其他的無活力的DNMT3B異構體的作用不同，所以不同的DNMT3B異構體的功能可能差異較大，僅僅從有無轉移酶活力還不能明確其對細胞的作用，因而要明確各種異構體的功能仍需進一步的研究。

[1]Kim GD，Ni J，Kelesoglu N，et al.Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5)methyltransferases [J].EMBO J，2002，21:4183-4195.

[2]Okano M，Xie S，Li E.Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5)methyltransferases[J].Nat Genet，1998，19:219-220.

[3]Wang J，Bhutani M，Pathak AK，et al.Delta DNMT3B variants regulate DNA methylation in a promoter-specific manner[J].Cancer Res，2007，67:10647-10652.

[4]Wang J，Walsh G，Liu DD，et al.Expression of Delta DNMT3B variants and its association with promoter methylation of p16 and RASSF1A in primary non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2006，66:8361-8366.

[5]Wang L，Wang J，Sun S，et al.A novel DNMT3B subfamily，DeltaDNMT3B，is the predominant form of DNMT3B in non-small cell lung cancer [J].Int J Oncol，2006，29:201-207.

[6]Gopalakrishnan S，Van Emburgh BO，Shan J，et al.A novel DNMT3B splice variant expressed in tumor and pluripotent cells modulates genomic DNA methylation patterns and displays altered DNA binding[J].Mol Cancer Res，2009，7:1622-1634.

[7]Shao G，Zhang R，Zhang S，et al.Splice variants DNMT3B4 and DNMT3B7 overexpression inhibit cell proliferation in 293A cell line[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2013，49:386-394.

[8]Saito Y，Kanai Y，Sakamoto M，et al.Overexpression of a splice variant of DNA methyltransferase 3b，DNMT3b4，associated with DNA hypomethylation on pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99:10060-10065.

[9]Shah MY，Vasanthakumar A，Barnes NY，et al.DNMT3B7，a truncated DNMT3B isoform expressed in human tumors，disrupts embryonic development and accelerates lymphomagenesis[J].Cancer Res，2010，70:5840-5850.

[10]Li JY，Pu MT，Hirasawa R，et al.Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and Nanog[J].Mol Cell Biol，2007，27:8748-8759.

[11]Gordon CA，Hartono SR，Chedin F.Inactive DNMT3B splice variants modulate de novo DNA methylation [J].PLoS One，2009，8:e69486.doi:10.1371/journal.pone.0069486.