羅 駿，王聰懿，吳慶琛

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 胸心外科，重慶400010)

中國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，食管癌最常見的類型為鱗狀細胞癌[1]。順鉑是臨床治療食管癌的常用藥物，但常常會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，因此尋找低毒、高效的抗食管腫瘤藥物成為目前研究的熱點之一。蟲草素是從真菌蛹蟲草中分離出來的核苷類抗生素，其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、消炎、抗菌，抗病毒等多種生理功效[2-4]。核因子NF-κB 存在于多種細胞通路中，在腫瘤化療過程中可以被激活，越來越多的證據(jù)表明其持續(xù)活化與腫瘤細胞耐藥的發(fā)生和發(fā)展密切相關[5-7]，據(jù)報道蟲草素具有抑制細胞核因子NF-κB 活性的功能[8-9]，可以推測蟲草素可能增強順鉑對食管癌細胞Eca109的化療敏感性。為此進一步研究了蟲草素和順鉑單獨或聯(lián)合應用對Eca109細胞的作用及其對NF-κB 信號通路的影響，為蟲草素作為輔助藥物治療食管癌和解決腫瘤耐藥問題提供一定的理論依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟲草素(中國食品藥品鑒定研究所);順鉑(齊魯制藥有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTS)(Promega 公司);食管癌細胞系Eca109(重慶醫(yī)科大學分子與腫瘤實驗室饋贈);兔抗人NF-κB P65、Histone H3(Cell Signaling 公司);TransAMTMNF-κB P65 活性檢測試劑盒和核蛋白提取試劑盒(Active-Motif 公司);兔抗人Bcl-2、Bax 和β-actin(Bioword公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP 標記山羊抗兔IgG、細胞裂解液、PMSF、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、5X的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液和Hoechest 33258(江蘇碧云天生物技術研究所);ECL 發(fā)光試劑盒(Thermo Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):Eca109細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%以上時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 MTS法檢測蟲草素和順鉑對Eca109細胞的增殖抑制率:取對數(shù)生長期細胞，消化后調(diào)整細胞濃度為8×104/mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液90 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁良好后加藥處理。陰性對照組加入培養(yǎng)基10 μL，溶劑對照組加0.9%氯化鈉溶液10 μL，空白對照不加細胞只加培養(yǎng)基100 μL。蟲草素處理濃度分別為35、70、105、140 和175 μg/mL，順鉑處理濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 μg/mL，聯(lián)合處理組加入蟲草素(70 μg/mL)和順鉑(0.8 μg/mL)，每組各設3個復孔。聯(lián)合組中蟲草素濃度與順鉑濃度是通過MTS 檢測細胞增殖篩選得到的，且對細胞作用的效果接近。24 h后取出培養(yǎng)板，進行MTS 檢測。每孔加入MTS 溶液20 μL，孵育2 h后，用酶標儀于490 nm 處測出各孔吸光度(A)值。細胞增殖抑制率=(陰性對照組A值一實驗組A值)/(陰性對照組A值－空白對照組A值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33258 染色法檢測細胞凋亡:實驗分對照組，單用順鉑組(0.8 μg/mL)，單用蟲草素組(70 μg/mL)和聯(lián)合用藥組(順鉑0.8 μg/mL+蟲草素70 μg/mL)。待細胞貼壁后加藥處理，然后再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS 洗1次，加入細胞固定液室溫固定15 min，PBS 洗2次，加入Hoechst 33258，37℃染色30 min，封片，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:分組處理24 h后，用預冷PBS 洗滌3次，胰蛋白酶消化后，收集細胞于離心管中，PBS 洗滌3次，93×g，離心5 min，然后將細胞懸液置于1 mL EP 管中，送重慶醫(yī)科大學生命科學院，采用流式細胞術annexin Ⅴ-FITC/PIC雙染法檢測細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 法檢測Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65 及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達:收集各分組細胞，提取細胞總蛋白及核蛋白。用BCA 比色法測蛋白濃度，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min，行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃下與一抗孵育過夜，以TBST 漂洗后加入二抗常溫孵育2 h，洗膜后用顯色劑ECL 試劑顯色、曝光。

1.2.5 ELISA法檢測Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65與DNA 結(jié)合活性:分組處理24 h 收集各組細胞，提取細胞核蛋白，應用TransAMTMNF-κB P65 活性檢測試劑盒測定NF-κB P65表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素和順鉑對Eca109細胞的增殖影響

蟲草素和順鉑均能呈濃度依賴性抑制Eca109細胞的增殖;蟲草素與順鉑聯(lián)合應用使順鉑對Eca109細胞的抑制率由29.3%增加至70.41%(P＜0.05)，增強了順鉑對Eca109的敏感性(表1)。

表1 不同濃度的順鉑或/和蟲草素對Eca109 增殖的影響Table1 The effect on cell proliferation of Eca109 cell by different treatment concentration of cordycepin or/and cisplatin(±s，%，n=3)

表1 不同濃度的順鉑或/和蟲草素對Eca109 增殖的影響Table1 The effect on cell proliferation of Eca109 cell by different treatment concentration of cordycepin or/and cisplatin(±s，%，n=3)

＊P＜0.05 compared with cisplatin or cordycepin alone group.

drug cordycepin/(μg/mL)35 70 105 140 175 inhibition 9.5±2.4 29.3±2.5 35.0±1.9 47.6±2.3 61.5±4.7 drug cisplatin/(μg/mL)0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 cordycepin(70)cisplatin(0.8)inhibition 17.2±1.0 30.1±1.9 36.3±2.148.3±7.1 63.4±4.7 70.4±3.1*

2.2 Hoechst 33258 染色法檢測蟲草素和順鉑對Eca109細胞凋亡

對照組的Eca109細胞發(fā)出較弱的均勻的藍色熒光，細胞核無明顯的形態(tài)學改變(圖1A 箭頭所示);而實驗組凋亡細胞出現(xiàn)核濃染、碎裂，發(fā)出較強的藍色熒光(圖1B、1C、1D 箭頭所示)。蟲草素與順鉑聯(lián)用出現(xiàn)凋亡像的細胞數(shù)量明顯多于二者單用(圖1)。

圖1 Hoechst 33258 染色法檢測蟲草素和順鉑對細胞凋亡的影響Fig1 Hochest33258 staining to observe each cell apoptosis by using cisplatin and cordycepin(×200)

2.3 流式細胞術檢測蟲草素和順鉑對Eca109細胞凋亡的影響

對照組、順鉑單藥組、蟲草素單藥組和聯(lián)合用藥組的凋亡率分別為2.75%±0.12%、14.50%±1.83%、13.80%±1.73%和41.15%±2.65%。而聯(lián)合組顯著高于各藥單用組和對照組(P＜0.05)，表明蟲草素能夠增強順鉑對Eca109的凋亡誘導效應(圖2)。

圖2 流式細胞術測得各組細胞的凋亡率Fig2 Each group of cells apoptosis rate by FCM

2.4 蟲草素和順鉑對Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65表達的影響

蟲草素能夠抑制Eca109細胞核NF-κB P65 蛋白的表達，而順鉑則引起胞核NF-κB P65 蛋白表達和活性升高;二者聯(lián)合給藥后NF-κB P65 蛋白表達和活性顯著降低(P＜0.05)(圖3，表2)。

圖3 Western blot(A)和ELISA (B)檢測Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65表達影響Fig3 Expression of NF-κB P65 in Eca109 nucleus by Western blot(A)and ELISA(B)

表2 Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65表達量Table2 NF-κB P65 protein expression in Eca109 nucleus(±s，n=3)

表2 Eca109細胞核內(nèi)NF-κB P65表達量Table2 NF-κB P65 protein expression in Eca109 nucleus(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with cisplatin，cordycepin and control group.

group/method Western blot ELISA control 0.559 4±0.079 5 0.330 7±0.043 7 cisplatin 0.589 6±0.019 8 0.420 6±0.032 1 cordycepin 0.514 5±0.021 7 0.209 1±0.089 6 combination 0.327 9±0.135 1* 0.110 3±0.042 0*

2.5 蟲草素和順鉑對Eca109細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達的影響

與對照組相比，蟲草素和順鉑均能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，而上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，二者聯(lián)合給藥后Bcl-2的表達顯著降低(P＜0.05)，而Bax表達顯著升高(P＜0.05)(圖4，表3)。

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2 蛋白的表達量Table3 Expression index of Bax，Bcl-2 protein in groups of cells(±s，n=3)

表3 各組細胞中Bax、Bcl-2 蛋白的表達量Table3 Expression index of Bax，Bcl-2 protein in groups of cells(±s，n=3)

＊P＜0.05 compared with cisplatin，cordycepin and control group.

group/protein Bcl-2 Bax control 0.697 1±0.017 9 0.335 4±0.104 1 cisplatin 0.560 3±0.018 6 0.509 8±0.180 4 cordycepin 0.580 9±0.167 7 0.561 0±0.078 0 combination 0.378 8±0.098 1* 0.753 1±0.310 4*

圖4 各組細胞中Bax、Bcl-2 蛋白的表達水平Fig4 Expression of Bax、Bcl-2 protein in groups of cells

3 討論

順鉑是治療食管癌常用的化療藥物，然而其容易產(chǎn)生耐藥和不良反應較大使患者難以承受。NF-κB作為一種特異性核轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤的增殖，抗凋亡，轉(zhuǎn)移和浸潤中起著重要作用[10-11]。在靜止細胞中，胞漿中的NF-κB P65 和其抑制性因子IκBα 結(jié)合，使NF-κB P65 無法進入核內(nèi)，其轉(zhuǎn)錄功能受到抑制。當細胞受活化刺激后，IκBα 末端的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化和泛素化，復合物發(fā)生解離，釋放出游離的NF-κB P65 得以進入細胞核，與靶基因上的κB序列特異結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

近年來許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥的機制可能與NF-κB的活化密切相關[5-7]。與順鉑敏感的細胞卵巢癌細胞A2780 相比，順鉑耐藥的卵巢癌細胞C200的NF-κB P65 活性增高[12]。相關文獻報道[7-8]蟲草素在體外能夠抑制細胞核因子NF-κB表達，因此可以推測蟲草素可能增強順鉑對食管癌細胞Eca109的凋亡誘導作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)蟲草素與順鉑聯(lián)合應用使順鉑對Eca109細胞的抑制率顯著增加，增強了順鉑對Eca109的敏感性;Hoechst 33258 染色法及流式細胞術結(jié)果均顯示，聯(lián)合用藥組顯著高于各單用藥組，表明蟲草素能夠增強順鉑對Eca109的凋亡誘導效應。然后對蟲草素增強順鉑對Eca109的凋亡誘導效應的機制進行了研究。研究表明蟲草素能夠抑制Eca109細胞核NF-κB P65 蛋白的表達及其與DNA結(jié)合活性，而順鉑則引起胞核NF-κB P65 蛋白表達和活性升高，二者聯(lián)合給藥后NF-κB P65 蛋白表達和活性顯著降低。說明順鉑用于腫瘤細胞后可以誘導細胞凋亡，同時也可以不同程度的激活NF-κB，這可能與順鉑的耐藥有關，而蟲草素卻能夠抑制NF-κB的激活，二者聯(lián)合給藥后增強順鉑對Eca109的凋亡誘導效應。

Bcl-2和Bax是NF-κB 通路的下游信號分子，與蟲草素和順鉑單用相比，聯(lián)合用藥后Bcl-2的表達顯著降低，而Bax表達顯著升高。凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax 屬于Bcl-2 蛋白家族成員，Bcl-2與Bax的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[13-14]。

綜上所述，實驗證實了蟲草素能夠增強順鉑對Eca109的凋亡誘導效應，其作用機制可能與蟲草素抑制NF-κB 途徑，調(diào)節(jié)下游信號分子Bcl-2和Bax的表達有關，這為蟲草素單獨或聯(lián)合其他藥物治療食管癌提供了一定的實驗依據(jù)。然而蟲草素是如何抑制NF-κB 信號分子的以及在體內(nèi)抗腫瘤效果如何，尚不清楚，有待進一步的研究和探討。

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