陳忠鋒，夏楠楠，何 兵

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州450000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)主要病因之一。腎小管間質(zhì)纖維化是DN 進(jìn)展過(guò)程中起決定作用的組織學(xué)改變，關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。研究表明補(bǔ)體C3 裂解產(chǎn)物C3a 可能是蛋白尿造成腎小管間質(zhì)纖維化的因素之一。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用糖尿病腎病患者蛋白尿及C3a 受體拮抗劑離體培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells，hRTECs)，觀察其轉(zhuǎn)分化情況及其相關(guān)指標(biāo)變化。

1 材料與方法

1.1 主要材料:選用hRTECs 為研究對(duì)象。兔抗人GAPDH 單克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和兔抗人E 鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Abcam 公司)，兔抗C3aR 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)。C3aELISA 試劑盒(上海生工公司)。C3a 受體拮抗劑SB290157(Calbiochem 公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取與鑒定:選取確診為糖尿病腎?、羝?0例患者的清潔中段尿液。沉淀濃縮尿蛋白，超濾滅菌。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。進(jìn)行蛋白質(zhì)量驗(yàn)證，排除細(xì)菌和尿液混入，－70℃保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:hRTECs 培養(yǎng)于含10%牛胎血清DMEM 培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 進(jìn)行基同步化處理，后更換為條件培養(yǎng)基依次分組為:1)按不同尿蛋白濃度:對(duì)照組、1.0、3.0 和8.0 mg/mL 組;2)按不同處理培養(yǎng)基:對(duì)照組、尿蛋白濃度8.0 mg/mL、尿蛋白濃度8.0 mg/mL+SB290157 組。

1.2.3 檢測(cè)相關(guān)指標(biāo):Western blot檢測(cè)各組E-cadherin、α-SMA、C3aR 蛋白表達(dá)情況，Image J 軟件分析目的條帶吸光度值。相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。按ELISA 試劑盒操作，檢測(cè)各組上清液C3a濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，LSD 法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度尿蛋白培養(yǎng)hRTECs，檢測(cè)表型標(biāo)記蛋白及C3aR 變化(圖1)。

圖1 不同濃度尿蛋白培養(yǎng)hRTECs 細(xì)胞的表型標(biāo)記蛋白和C3aR 變化Fig1 Changes of phenotypic marker protein and C3aR in cultured hRTECs treated with different concentrations of urinary protein

2.2 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中C3a濃度(圖2)。

圖2 ELISA法檢測(cè)用不同濃度蛋白尿培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中C3a濃度Fig2 Using ELISA to analyse C3a in cell culture supernatant of different concentrations proteinuria (±s，n=3)

2.3 不同處理?xiàng)l件培養(yǎng)基培養(yǎng)hRTECs，檢測(cè)表型標(biāo)記蛋白變化(圖3)。

圖3 不同處理?xiàng)l件培養(yǎng)基hRTECs 細(xì)胞表型標(biāo)記蛋白變化Fig3 Phenotype marker protein changes in different treatments media of hRTECs

3 討論

DN是導(dǎo)致ESRD的主要病因之一。慢性腎臟疾病進(jìn)展至后期的組織學(xué)改變是腎小管間質(zhì)纖維化，而其纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是發(fā)生EMT。

C3a具有趨化激活白細(xì)胞、介導(dǎo)炎性反應(yīng)的作用。C3aR為C3a 受體，它不僅存在于噬中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面，也存在于腎臟細(xì)胞表面。研究認(rèn)為小球?yàn)V過(guò)或小管腔內(nèi)活化的補(bǔ)體成分是蛋白尿腎病中導(dǎo)致小管間質(zhì)損傷主要因素之一[1]。糖尿病db/db小鼠的近曲小管和足細(xì)胞的C3aR高表達(dá)，推測(cè)糖尿病腎病可能與補(bǔ)體激活有關(guān)[2]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用糖尿病腎病Ⅳ期患者的尿蛋白離體培養(yǎng)hRTECs，其發(fā)生了轉(zhuǎn)分化，E-cadherin表達(dá)量下調(diào)，α-SMA、C3aR表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞上清液C3a 水平也升高，表明尿蛋白可致hRTECs 發(fā)生EMT，而這一過(guò)程可能與尿蛋白中C3a的水平升高，C3aR表達(dá)上調(diào)有關(guān)。這與報(bào)道[3]用C3a 刺激人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)C3a 參與誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)分化的結(jié)論相一致。當(dāng)應(yīng)用了C3aR 特異性拮抗劑SB290157，發(fā)現(xiàn)SB290157 組hRTECs 轉(zhuǎn)分化減輕。這一結(jié)果表明在糖尿病腎病患者尿蛋白中C3a 參與導(dǎo)致hRTECs 轉(zhuǎn)分化，抑制C3aR 可以使其轉(zhuǎn)分化減輕。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3a及其受體在糖尿病腎病腎小管轉(zhuǎn)分化的過(guò)程中起著十分重要的作用。因此抑制補(bǔ)體的激活可能成為減輕糖尿病腎病間質(zhì)纖維化，延緩其進(jìn)展的新治療靶點(diǎn)。

[1]鄭敬民，朱小東，張明超，等.高表達(dá)C3aR的肥大細(xì)胞在糖尿病腎病患者腎組織中的分布及病理意義分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2011，38:262-268.

[2]Zheng JM，Zhu XD，Zhang MC，et al.Expression and possible role of C3aR in the kidney of Diabetic db/db mice[J].Prog Biochem Biophys，2010，37:847-854.

[3]Tang Z，Lu B，Hatch E，et al.C3a mediates epithelial-tomesenchymal transition in proteinuric nephropathy[J].Am Soc Nephrol，2009，20:593-603.