郭春喜　高宇瓊

摘要：優(yōu)化超聲波提取梵凈山石斛（Dendrobium fanjingshanense）多糖的最佳工藝條件，可為梵凈山石斛多糖的開發(fā)應(yīng)用提供參考。以梵凈山石斛為原料，考察料液比（g∶mL）、提取溫度、提取時(shí)間對梵凈山石斛多糖提取率的影響，并采用正交試驗(yàn)對梵凈山石斛多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，各因素對梵凈山石斛多糖提取率的影響順序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>提取溫度。最佳提取工藝為料液比為1∶35，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為40 min。在最佳工藝條件下，超聲波對梵凈山石斛多糖的提取率為9.83%。

關(guān)鍵詞：梵凈山石斛（Dendrobium fanjingshanense）；多糖；正交試驗(yàn)；超聲波

中圖分類號(hào)：R284.2；S682.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1448-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.042

Abstract： The ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Dendrobium fanjingshanense was optimized with orthogonal test. The effects of the ratio of material to solution， extraction temperature， extraction time on extracting polysaccharides were studied. The factors affecting the extraction of polysaccharides from Dendrobium fanjingshanense were in the order of the ratio of material to solution > extraction time>extraction temperature. The optimal conditions were the ratio of material to solution of 1∶35（mg∶L）， 60 ℃ and 40 min. Under these conditions，the rate of polysaccharides extracted was 9.83%.

Key words： Dendrobium fanjingshanense； polysaccharides； orthogonal design； ultrasonic wave

梵凈山石斛（Dendrobium fanjingshanense）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium SW.）附生植物，是2001年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種[1]，為貴州特有藥用植物之一[2]。性味甘淡微咸，寒，歸胃、腎，主要用于治療口干、煩渴、熱病傷津、肺熱干咳、腰膝軟弱、陰傷目暗等病癥[3]，其花黃褐色或橙黃色，也可作觀賞植物。該植物分布區(qū)域狹窄，僅分布在貴州省梵凈山黑灣河海拔800～1 500 m處，導(dǎo)致種群數(shù)量稀少，不能進(jìn)行大范圍的開發(fā)利用。而梵凈山石斛組織培育苗的成功，為保護(hù)梵凈山石斛種質(zhì)資源及其藥用成分的開發(fā)與利用提供了有力支撐[4]，為本地區(qū)特色藥用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了途徑。

多糖是具有生物活性的聚合物，有復(fù)雜、多方面的生理活性和功能[5]。研究表明，石斛的水溶性多糖能夠有效地增強(qiáng)免疫反應(yīng)，有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗輻射、抗凝血的作用，且對機(jī)體毒副作用小[6-9]。因此，針對梵凈山石斛多糖的研究，對于開發(fā)和利用本地區(qū)的特有藥用植物資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 以貴州省銅仁金農(nóng)綠色農(nóng)業(yè)科技有限公司培育出的梵凈山石斛試管苗，經(jīng)煉苗后移植成活，栽培3年后的植株為材料，取其莖段為樣品。

1.1.2 儀器 AR124CN型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；SG5200HPT型臺(tái)式超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；80-2型離心沉淀機(jī)（江蘇金壇市中大儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；T6新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.1.3 試劑 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；苯酚、濃硫酸、乙醇、正丁醇、氯仿均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1.000 g溶于50 mL乙酸乙酯中，貯于棕色瓶中，置于黑暗中保存。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g，加去離子水溶解后用100 mL容量瓶定容，即得1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取標(biāo)準(zhǔn)品液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于具塞試管中，分別加去離子水至2.0 mL，各加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯溶液，迅速加入5.0 mL濃硫酸，振蕩搖勻，置于沸水浴10 min，取出迅速冷卻至室溫，以2.0 mL去離子水代替葡萄糖液為對照，在630 nm處測定吸光度。分別以質(zhì)量濃度（C）、吸光度（A）為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A= 1.551 4C+0.000 3，R2=0.999 4。

1.2.2 梵凈山石斛多糖含量的測定 將梵凈山石斛清洗干凈，研碎后60 ℃烘干、繼續(xù)粉碎得梵凈山石斛粗粉。稱取梵凈山石斛粗粉50 g，經(jīng)石油醚脫脂，在超聲波功率為80 W時(shí)提取多糖，抽濾，用無水乙醇沉淀24 h，以4 000 r/min離心20 min，去上清液，得到粗多糖。加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯溶液，再加入5.0 mL濃硫酸，置于沸水浴10 min，冷卻至室溫，然后按照蒽酮-硫酸法測定吸光度。按以下公式計(jì)算多糖提取率：

多糖提取率=[（A-0.000 3）/1.551 4×D×V/M]×100%

式中，A為吸光度；D為樣品液的稀釋倍數(shù)；V為浸提液的體積（mL）；M為取樣的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 以料液比（g∶mL，下同）分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，比較不同料液比對梵凈山石斛多糖提取率的影響；提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min，比較不同超聲波時(shí)間對梵凈山石斛多糖提取率的影響；提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，比較不同提取溫度對梵凈山石斛多糖提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 為優(yōu)化梵凈山石斛多糖的提取條件，本試驗(yàn)以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，用蒽酮-硫酸法測定多糖含量，并計(jì)算提取率。

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對梵凈山石斛多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份梵凈山石斛粗粉各0.500 0 g，按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同料液比，在提取溫度為60 ℃，超聲波時(shí)間為40 min的條件下， 比較不同料液比對梵凈山石斛多糖提取率的影響。每個(gè)料液比水平做3次重復(fù)試驗(yàn)后取平均值，結(jié)果見圖1。由圖1可知， 梵凈山石斛多糖提取率隨著料液比的降低呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)溶劑不斷地增加時(shí)， 多糖的溶解量會(huì)隨之增大，因此，隨著料液比降低多糖提取率也會(huì)增大。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)， 梵凈山石斛多糖提取率達(dá)到最大。但當(dāng)梵凈山石斛組織細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度達(dá)到近似平衡時(shí)， 即溶劑中的多糖含量上升到一定值時(shí)， 細(xì)胞內(nèi)的多糖不易溶解出，從而抑制了多糖提取率的增加。綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果， 從實(shí)際生產(chǎn)的操作性來說，確定超聲波提取梵凈山石斛多糖的料液比為1∶30或1∶35均可。

2.1.2 提取時(shí)間對梵凈山石斛多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份梵凈山石斛粗粉各0.500 0 g，按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同提取時(shí)間，在料液比為1∶30，提取溫度為60 ℃的條件下，比較不同提取時(shí)間對梵凈山石斛多糖提取率的影響。每個(gè)提取時(shí)間做3次重復(fù)試驗(yàn)后取平均值，結(jié)果見圖3。由圖3可知，梵凈山石斛多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，梵凈山石斛多糖提取率達(dá)到最大。提取時(shí)間太短不利于多糖的溶出，提取時(shí)間太長導(dǎo)致多糖分解和大量雜質(zhì)的溶出，進(jìn)而降低了多糖提取率。在提取時(shí)間為40 min時(shí)，超聲波對細(xì)胞的破碎作用達(dá)到最強(qiáng)，利于多糖的溶出，導(dǎo)致提取率最高。綜合考慮方差分析結(jié)果，從實(shí)際生產(chǎn)中的可操作性方面來說，以30 min或40 min的提取時(shí)間均可。

2.1.3 提取溫度對梵凈山石斛多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5份梵凈山石斛粗粉0.500 0 g，按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同提取溫度，在料液比為1∶30，超聲時(shí)間為40 min的條件下，比較不同提取溫度對梵凈山石斛多糖提取率的影響。每個(gè)提取溫度水平做3次重復(fù)試驗(yàn)后取平均值，結(jié)果見圖4。由圖4可知，梵凈山石斛多糖提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，梵凈山石斛多糖提取率達(dá)到最大。這可能因?yàn)檫m當(dāng)?shù)卦黾右簻乜梢源龠M(jìn)多糖的溶出，利于多糖提取。但隨著液溫的上升，過高的提取溫度會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使部分多糖發(fā)生降解而影響其活性[10]。再者，高溫導(dǎo)致液體中生存的氣泡會(huì)遮擋超聲波，使超聲波減弱，從而使提取率降低。綜合考慮試驗(yàn)和方差分析結(jié)果，在實(shí)際生產(chǎn)中以50 ℃或60 ℃作為梵凈山石斛多糖的提取溫度均可。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，多糖提取優(yōu)化試驗(yàn)的3個(gè)因素水平見表1。多糖提取率結(jié)果見表2。由極差分析可知，各因素對梵凈山石斛多糖提取率的影響主次順序?yàn)锳>C>B，即料液比>提取時(shí)間>提取溫度。方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，料液比的F>F0.05，即P<0.05，說明不同水平的料液比對多糖提取率的影響顯著，料液比為1∶35時(shí)提取效果最好；提取時(shí)間的F>F0.05，即P<0.05，說明不同水平的提取時(shí)間對多糖提取率的影響顯著，提取時(shí)間為40 min時(shí)提取效果最好；提取溫度對多糖提取率的影響不顯著。因此，梵凈山石斛多糖最佳提取條件為A3B3C2，即料液比為1∶35，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為40 min。實(shí)際生產(chǎn)中，考慮提取溫度對多糖影響不大，且高溫會(huì)增加能耗和成本投入，因此提取溫度為40～60 ℃均可。在正交試驗(yàn)中得到的最佳提取工藝條件下重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得提取率的平均值為9.83%，高于正交試驗(yàn)中的最高提取率9.78%，表明通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝，所得到的工藝穩(wěn)定、可靠。

3 小結(jié)與討論

對于石斛屬的多糖提取工藝研究中，大部分采用熱水浸提法、乙醇回流法等[11-13]，這類工藝有提取時(shí)間較長、提取溫度較高、提取率較低的缺點(diǎn)。本研究采用的超聲波輔助提取法具有提取溫度低、提取時(shí)間較短、提取率較高，且產(chǎn)品純化容易等優(yōu)點(diǎn)，更適合應(yīng)用于石斛屬植物的多糖提取[14]。

以梵凈山石斛為材料，采用超聲波法提取多糖，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化多糖提取工藝。由正交試驗(yàn)極差分析可知，各因素對多糖提取率的影響依次為料液比>提取時(shí)間>提取溫度，料液比、提取時(shí)間對多糖提取的影響顯著，提取溫度對多糖提取率的影響不顯著。超聲波提取梵凈山石斛多糖的最佳工藝為料液比1∶35，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間為40 min。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，梵凈山石斛多糖提取率平均值為9.83%。說明優(yōu)化后的提取工藝穩(wěn)定、可行。本研究可為梵凈山石斛藥用資源的開發(fā)利用提供參考。

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