楊常泉，王 偉，馬 融

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

茸菖膠囊對(duì)幼年大鼠癲癇后NRSF和BDNF蛋白表達(dá)的影響*

楊常泉，王 偉，馬 融

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究茸菖膠囊對(duì)幼年大鼠癲癇后神經(jīng)元限制性沉默因子（NRSF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）蛋白表達(dá)的影響。[方法]建立戊四唑點(diǎn)燃癲癇模型，分為中藥高、中、低劑量組、西藥組、模型組和空白組，用蛋白免疫印跡雜交法檢測(cè)各組NRSF和BDNF蛋白的變化。[結(jié)果]幼年大鼠致癇后模型組海馬NRSF和BDNF蛋白表達(dá)升高，中藥高劑量組可顯著降低大鼠海馬齒狀回NRSF和BDNF蛋白表達(dá)（P＜0.01），作用優(yōu)于西藥組和其他中藥組。[結(jié)論]中藥復(fù)方茸菖膠囊抗癲癇及改善癲癇后認(rèn)知障礙機(jī)制可能與調(diào)控組蛋白乙?；揎椉捌渌閷?dǎo)的神經(jīng)元基因表達(dá)有關(guān)。

癲癇；海馬；茸菖膠囊；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)元限制性沉默因子

組蛋白乙?；瘏⑴c了癲癇發(fā)作及癲癇后認(rèn)知功能的下降。神經(jīng)元限制性沉默因子（NRSF）與組蛋白乙?；芮邢嚓P(guān)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）有與NRSF結(jié)合的神經(jīng)限制性沉默元件（NRSE），其轉(zhuǎn)錄調(diào)控與組蛋白乙?；芮邢嚓P(guān)[1-2]。本研究采用出生后16 d（P16）的SD大鼠建立戊四唑點(diǎn)燃癲癇模型及茸菖膠囊的干預(yù)作用下，應(yīng)用蛋白免疫印跡雜交法檢測(cè)NRSF、BDNF蛋白在大鼠海馬區(qū)表達(dá)變化，探討中藥復(fù)方茸菖膠囊改善癲癇后認(rèn)知障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 16日齡Sprague-Dawley大鼠（P16）48 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（50±10）g，雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2007-005）。茸菖膠囊由天津市石天藥業(yè)公司提供（批件號(hào)：津藥制字Z20070735號(hào)），規(guī)格：每粒0.33 g，50粒/瓶。丙戊酸鈉口服溶液由賽諾菲安萬特制藥有限公司提供（國藥準(zhǔn)字H20041435），規(guī)格 300mL∶12 g。戊四唑由 Simga 公司提供（批號(hào)：P6500）。

1.2 模型制備與評(píng)價(jià) 采用戊四唑慢性點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型，參考王麗等[3]方法并加以改進(jìn)。從大鼠出生后17～45 d（P17～P45）開始，用戊四唑亞驚厥劑量37mg/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)28 d。停藥1周后（P52）再以相同劑量戊四唑腹腔注射，采用Racine評(píng)分法[4]凡顯示連續(xù)連續(xù)5次Ⅱ級(jí)及以上驚厥的大鼠，被認(rèn)為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。將出線Ⅳ級(jí)以上驚厥大鼠繼續(xù)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[5]篩選認(rèn)知障礙模型大鼠。

1.3 分組與處理 共設(shè)6組，包括：空白對(duì)照組、癲癇模型組、中藥治療組（茸菖膠囊低、中、高3個(gè)劑量組，劑量 1∶2∶4）；西藥對(duì)照組。各組給藥劑量按人與大鼠體表面積換算公式計(jì)算。1）空白對(duì)照組：不作處理。2）癲癇模型組：灌服生理鹽水10mL/kg，每日兩次，持續(xù)28 d。3）中藥治療組：將茸菖膠囊按生藥含量7.68、3.84、1.92 kg/L分別配制成相應(yīng)濃度的藥液，3組均按10 mL/kg灌藥，每日2次，持續(xù)28 d。4）西藥對(duì)照組：丙戊酸鈉400mg/kg給藥，每日2次，持續(xù)28 d。

1.4 標(biāo)本采集 各組大鼠出現(xiàn)驚厥發(fā)作后1 h，斷頭剝離海馬組織，轉(zhuǎn)至EP管，液氮固定，-80℃低溫保存。

1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè) 采用蛋白提取試劑盒加入磷酸酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗孵育，ECL反應(yīng)、膠片曝光。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物驚厥行為觀察 在腹腔注射亞驚厥劑量戊四唑7 d逐漸有興奮性增高的表現(xiàn)，如籠內(nèi)跑跳明顯增加，注射第10天起陸續(xù)出現(xiàn)如眨眼、動(dòng)須、點(diǎn)頭、頭部抽搐等程度不等的驚厥發(fā)作，注射20 d以后呈逐漸加重趨勢(shì)，尤其是注射30min后驚厥表現(xiàn)明顯，出現(xiàn)前肢抬起，全身痙攣抖動(dòng)等，精神狂躁不安，在飼養(yǎng)籠內(nèi)上下翻跳及狂奔伴有嘶叫,失去體位控制。而對(duì)照組大鼠無癇樣發(fā)作。

2.2 茸菖膠囊對(duì)海馬組織NRSF蛋白表達(dá)的影響 癲癇模型組大鼠海馬組織NRSF蛋白相對(duì)表達(dá)顯著高于其他各組（P＜0.01）；中藥高劑量組大鼠海馬齒狀回NRSF蛋白表達(dá)顯著低于中藥中劑量組、中藥低劑量組及西藥組（P＜0.01），西藥組大鼠海馬齒狀回NRSF蛋白表達(dá)顯著低于中藥中劑量組及中藥低劑量組（P＜0.01），而顯著高于中藥高劑量組（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠海馬組織NRSF蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠海馬組織NRSF蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.1 Expression of NRSF protein in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與空白對(duì)照組比較*P＜0.01；與癲癇模型組比較#P＜0.01，與西藥對(duì)照組比較△P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) NRSF空白對(duì)照組 8 0.57±0.06癲癇模型組 7 1.41±0.06*西藥對(duì)照組 7 1.12±0.06*#中藥高劑量組 8 0.90±0.04*#△中藥中劑量組 8 1.22±0.04*中藥低劑量組 8 1.30±0.047*

2.3 茸菖膠囊對(duì)海馬BDNF蛋白表達(dá)的影響 其他各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除中藥中、低劑量組外，其他各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)與癲癇模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與西藥對(duì)照組比較，中藥高劑量組大鼠海馬齒狀回BDNF蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組海馬BDNF蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

表2 各組海馬BDNF蛋白表達(dá)的比較（±s）Tab.2 Expression of BDNF protein in hippocampus in each group（±s）

注：與空白對(duì)照組比較*P＜0.01；與癲癇模型組比較#P＜0.01，與西藥對(duì)照組比較△P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) NRSF空白對(duì)照組 8 0.52±0.10癲癇模型組 7 0.95±0.34*西藥對(duì)照組 7 0.73±0.11*#中藥高劑量組 8 0.70±0.18*#中藥中劑量組 8 0.80±0.04*#△中藥低劑量組 8 0.87±0.26*△

3 討論

組蛋白的乙?；且粋€(gè)與基因轉(zhuǎn)錄活性高低密切相關(guān)的動(dòng)態(tài)過程，組蛋白乙?；郊捌湔{(diào)控致癇相關(guān)基因的表達(dá)是癲癇發(fā)作及癲癇后認(rèn)知功能下降的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一[6-7]。NRSF與組蛋白乙?；芮邢嚓P(guān)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生和癲癇發(fā)病中起著十分重要的作用。NRSF招募共阻遏子Sin3A及CoREST，后兩者再招募HDACs到核小體附近，引發(fā)組蛋白低乙?；癄顟B(tài)，進(jìn)而抑制了轉(zhuǎn)錄。Ballas等[8]報(bào)道NRSF及其所介導(dǎo)的基因表達(dá)參與了癲癇發(fā)生及癲癇后認(rèn)知功能的下降。BDNF與癲癇后認(rèn)知功能的下降密切相關(guān)。BDNF基因有與NRSF結(jié)合的NRSE，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控與組蛋白乙?；芮邢嚓P(guān)。癇性發(fā)作激發(fā)BDNF的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，促進(jìn)了海馬苔蘚纖維出芽及突觸重組[9-10]。

抗癲癇藥丙戊酸（VPA）已被證實(shí)是HDACs抑制劑，其可以增加了小鼠海馬區(qū)H3的乙?；x擇性激活了神經(jīng)元BDNF啟動(dòng)子，抑制癲癇齒狀回的NRSF表達(dá)，使NRSF依賴基因表達(dá)正?；?，阻止癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)發(fā)生，減少認(rèn)知功能障礙[11]。

馬融教授認(rèn)為小兒癲癇伴認(rèn)知障礙的病機(jī)關(guān)鍵在于“腎精虧虛、風(fēng)痰閉阻”，治療上以“益腎填精、豁痰熄風(fēng)”立法，前期臨床研究表明茸菖膠囊不僅可以有效減輕癲癇的造成的認(rèn)知障礙，而且可以有效控制癲癇的發(fā)作[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼年大鼠致癇后模型組海馬NRSF和BDNF蛋白表達(dá)升高，中藥高劑量組可顯著降低大鼠海馬齒狀回NRSF和 BDNF蛋白表達(dá)（P＜0.01），作用優(yōu)于西藥對(duì)照組和其他中藥組。提示癲癇后神經(jīng)發(fā)生與組蛋白乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)，中藥填精充髓、豁痰熄風(fēng)法復(fù)方茸菖膠囊通過調(diào)控組蛋白乙酰化水平調(diào)控神經(jīng)發(fā)生進(jìn)而改善癲癇大鼠認(rèn)知障礙可能是其抗癇增智作用的多靶點(diǎn)機(jī)制之一。

[1]陳 剛,鄧艷春.組蛋白乙?；c癲癇相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2008,7（2）:188-190.

[2]Urdinguio RG，Sanchez-Mut JV，Esteller M.Epigeneticmechanisms in neurological diseases：genes，syndromes，and therapies[J].Lancet Neurol，2009，8：1056-1072.

[3]王 麗,JOno,PDWalson.大鼠戊四唑點(diǎn)燃模型的建立[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1993,28(7)∶486.

[4]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulationⅡ.Motor seizure[J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32(3)：281-294.

[5]Li J,Takeda Y,Hirakawa M.Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex[J].JNeurosurg Anesthesiol,2000,12(3):247-254.

[6]Urdinguio RG，Sanchez-Mut JV，Esteller M.Epigeneticmechanisms in neurological diseases：genes，syndromes，and therapies[J].Lancet Neurol，2009，8：1056-1072.

[7]Francis YI，F(xiàn)àM，Ashraf H，et al.Dysregulation of his tone acetylation in the APP/PS1mousemodel of Alzheimer's disease[J].J AlzheimersDis，2009，18：131-139.

[8]Ballas N，Grunseich C，Lu DD，et al.REST and its corepressors mediate plasticity of neuronal gene chromatin throughout neurogenesis[J].Cell，2008，121（4）：645-657.

[9]張麗娜,武士京,陶華英,等.低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激治療難治性癲癇大鼠模型及對(duì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)肽Y表達(dá)的影響[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2011,11(4):428-433.

[10]趙 姝,韓大勇,王秀杰.BDNF及其受體TrkB在不同程度癲癇患者顳葉或海馬中的差異性表達(dá) [J].黑龍江醫(yī)學(xué),2011,35(9):641-644.

[11]Sebastian J，Kinichi N，Gregory CJ，et al.Epigenetic Modulation of Seizure-Induced Neurogenesisand Cognitive Decline[J].JNeurosci,2007，27（22）:5967–5975.

[12]楊常泉，馬 融，閆景瑞.茸菖膠囊對(duì)戊四唑點(diǎn)燃模型大鼠海馬BDNF及其受體TrkB表達(dá)的影響[J].天津中醫(yī)藥，2013,30（7）：423-426.

[13]戎萍，張喜蓮，馬融，等.“從腎論治”小兒癲癇的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,31(3):140-143

Effectof Rongchang capsuleson expressionsof NRSF and BDNF in hippocam pusof epilepsy rats

YANGChang-quan,WANGWei,MARong
（The FirstAffilited Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]Toexplore theeffectofRongchang capsules(RCC)on the protein expression ofneuronal restricted silencing factor(NRSF)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in hippocampusafter pentylenetetrazole(PTZ)induced epileptic seizure in young rats.[Methods]Toestablish the PTZkindlingmodelofepilepsy,the ratswere randomly divided into normalgroup,modelgroup,valproic acid sodium(VPA)group and RCC low,middle,high dosage group.The expression ofNRSF protein and BDNF proteinwere detected by theWestern blot hybridization assay.[Results]The expression of NRSF protein and BDNF protein in hippocampus of rats inmodel groupswere significantly higher than those in the blank group,and the differencewas statistically significant(P<0.05).Each treatgroup could reduce the expression,butRCC high dose group was better than VPA and RCC low,middle dosage group(P<0.05).[Conclusion]Themechanism of RCC antiepilepsy and improvement cognitive impairmentafter epilepsymay be related to the inhibition of NRSF and BDNFprotein expression in juvenile rathippocampusafterepilepsy.

epilepsy;hippocampus;Rongchang capsule;brain derived neurotrophic factor;neuronal restricted silencing factor

R742.1

A

1672-1519（2015）09-0555-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.09.12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173301，30973772）；國家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81001539）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃（10JCZDJC20600，11JCYBJC12300）。

楊常泉（1975-），男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療小兒腦病的研究。

馬 融，E-mail:mr1974@163.com。

2015-04-26）

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