許針針，張 莉，王玉敏，李東亮，高 艷，高玉光，

(山東 濱州 256603:1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科;2.濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院)

Smad蛋白家族作為細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在TGF－β超家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，TGF－β/Smad3信號通路可通過Smad3與Amelotin啟動子上的Smad3結(jié)合位點(diǎn)相互作用，進(jìn)而調(diào)控成釉細(xì)胞Amelotin基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性［1］。Smad3在釉質(zhì)礦化過程中發(fā)揮著重要作用，Smad3(－/－)小鼠可出現(xiàn)釉質(zhì)礦化缺陷［2］。釉質(zhì)成熟蛋白(Amelotin，AMTN)是成熟期成釉細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白，該蛋白可影響釉質(zhì)成熟［3］。因此，轉(zhuǎn)錄因子 Smad3和 Amelotin基因均與釉質(zhì)發(fā)育有密切關(guān)系，研究Smad3和Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的關(guān)系已成為一個重要方向。

本研究通過構(gòu)建不同長度Amelotin啟動子熒光素酶報告基因載體，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析Smad3對Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響;同時在發(fā)現(xiàn)新的啟動子功能性序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究分析，確定Smad3與Amelotin的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，以期為今后進(jìn)一步研究牙體硬組織發(fā)育過程中相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Smad3抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國);基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);PCR引物合成、EMSA探針合成、pMD18－T克隆載體、Taq plus酶、T4 DNA連接酶(TaKaRa，日本);質(zhì)粒 pGL3－Basic、pGL3－Control、pRL40、限制性內(nèi)切酶(KpnI、BglⅡ、MluI、XhoI)、TransFastTMTransfection Reagent、Dual－Luciferase? 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒(Promega，美國);E.coli DH5α菌株(本實(shí)驗(yàn)室保存);質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒(上海生工);質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen，德國);小鼠成釉細(xì)胞系(日本Akita大學(xué)醫(yī)學(xué)院Sugiyama教授饋贈);HEK 293T細(xì)胞(ATCC，美國);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國);胰蛋白酶(Gibco，美國);pcDNA3.1/myc－HisA(Invitrogen，美國);pcDNA3.1/Smad3－mychisA(Smad3)(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存);Biotin 3'End DNA Labeling Kit、NE － PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents、LightShift Chemiluminescent EMSA Kit、Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module(Pierce，美國);ChemiScope series(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所);Amersham Hybond－N+帶正電荷尼龍膜(北京賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 小鼠Amelotin基因啟動子的克隆及Smad3對Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性影響的觀察

1.2.1 基因組DNA的提取

使用基因組DNA提取試劑盒從小鼠的成釉細(xì)胞中提取基因組DNA，操作步驟按照基因組DNA提取試劑盒的使用說明進(jìn)行。

1.2.2 Amelotin 基因啟動子的克隆

根據(jù)已知小鼠Amelotin基因序列設(shè)計引物(表1)，以上述提取的成釉細(xì)胞DNA為模板，利用PCR儀擴(kuò)增不同長度的Amelotin啟動子片段。將PCR產(chǎn)物直接與克隆載體pMD18－T連接后，轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli DH5α中，并置于含有Amp的LB培養(yǎng)板上37℃倒置培養(yǎng)。分別取陽性菌落進(jìn)行細(xì)菌的小量培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒DNA。所提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)KpnI、BglⅡ酶切后，進(jìn)行瓊脂糖電泳以確定擴(kuò)增產(chǎn)物，并分別命名為 T－M1、T－M2、T－M3、T －M4、T－M5、T－M6。利用帶有相應(yīng) MluI、XhoI酶切位點(diǎn)的引物，并以與引物對應(yīng)的T－M1、T－M2、T－M3、T－M4、T－M5、T－M6 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物和熒光素酶表達(dá)載體pGL3－Basic，用限制性內(nèi)切酶MluI、XhoI分別進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)純化和回收后，在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜;連接產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步酶切后進(jìn)行測序鑒定。鑒定正確后將不同長度Amelotin啟動子片段與pGL3－Basic基因克隆所得到的重組熒光素酶報告基因載體分別命名為 M1、M2、M3、M4、M5、M6。

表1 用于克隆含不同長度Amelotin啟動子的熒光素酶報告基因載體的引物

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

小鼠成釉細(xì)胞(ALC)經(jīng)常規(guī)復(fù)蘇后接種于含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。取第3代小鼠成釉細(xì)胞鋪板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿孔底70% ～80%時，參照TransFastTMTransfection Reagent操作說明，以pRL40作為內(nèi)參照，將相同劑量的 pcDNA3.1/myc－HisA、pcDNA3.1/Smad3－myc－HisA 分別與 M1、M2、M3、M4、M5、M6、pGL3－Basic共同轉(zhuǎn)染成釉細(xì)胞(每組復(fù)3孔)，繼續(xù)培養(yǎng)32 h后進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測Smad3對不同長度Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

轉(zhuǎn)染完成后，參照Dual－Luciferase?雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒說明進(jìn)行檢測:每孔加入細(xì)胞裂解液PLB裂解細(xì)胞，待細(xì)胞裂解完全后，各取20 μL細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至上樣管中，分別加入100 μL LARⅡ并混勻后，置于熒光發(fā)光儀上檢測螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U1);然后再分別加入 100 μL Stop＆Glo試劑，混勻后檢測樣品中海腎熒光素酶(Renilla luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值(U2)。以每一樣品所測得的數(shù)值U1與U2之比作為該報告基因的相對熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 Smad3和Amelotin基因啟動子特異性結(jié)合位點(diǎn)之間相互作用的觀察

1.3.1 人和小鼠 Amelotin基因啟動子片段(－160 ～ +196)的序列比對

利用軟件 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對人和小鼠的Amelotin基因啟動子序列(－160～+196)進(jìn)行BLAST分析，觀察人和小鼠兩序列的同源性。生物信息軟件分析，在序列(－140～－136)和(－83～－79)區(qū)域有潛在的Smad3結(jié)合位點(diǎn)，故針對這兩個潛在結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計探針。

1.3.2 細(xì)胞核蛋白的準(zhǔn)備

HEK 293T細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后接種于含100 mL/L胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。取第3代293T細(xì)胞鋪板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿孔底50%～60%時，按照磷酸鈣轉(zhuǎn)染的操作說明，將相同劑量的 pcDNA3.1/myc－HisA、pcDNA3.1/Smad3－myc－HisA分別以磷酸鈣 －DNA沉淀的方式轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后36 h，參照 NE－PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents操作說明提取細(xì)胞核蛋白，并以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定核蛋白的濃度。然后將pcDNA3.1/Smad3－myc－HisA轉(zhuǎn)染后提取的核蛋白分別命名為:NP－h(huán)isA、NI－Smad3。

1.3.3 EMSA 探針的準(zhǔn)備

參照Biotin 3'End DNA Labeling Kit操作說明對野生型探針單鏈分別進(jìn)行標(biāo)記，并在使用前進(jìn)行退火合成雙鏈;然后將site1、site2兩個位點(diǎn)相對應(yīng)的野生型標(biāo)記探針分別命名為:Probe－WT1、Probe－WT2。

1.3.4 觀察 Smad3和Amelotin基因啟動子特異性結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合

Smad3與Amelotin基因啟動子特異性結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合反應(yīng)嚴(yán)格按照LightShift Chemiluminescent EMSA Kit操作說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程如下:①將核蛋白 NP－h(huán)isA、NP－Smad3分別與探針Probe－WT1、Probe－WT2 進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，其反應(yīng)體系于室溫下孵育30 min后，用60 mL/L非變性膠在0.5x TBE緩沖液中冰上預(yù)電泳60 min，然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、交聯(lián);交聯(lián)后的N+帶正電荷尼龍膜按照Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module操作說明進(jìn)行封閉反應(yīng)，HRP標(biāo)記、沖洗、平衡之后，將化學(xué)發(fā)光底物作用于尼龍膜上，并通過化學(xué)發(fā)光儀檢測、分析結(jié)果;②在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，再由核蛋白 NP－Smad3分別與探針Probe－WT2、野生型未標(biāo)記探針、突變探針、anti－Smad3 antibody進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)和supershift實(shí)驗(yàn)，分為4組，組1為核蛋白NP－Smad3+探針Probe－WT2;組2為核蛋白NP－Smad3+突變探針+探針Probe－WT2;組3為核蛋白 NP－Smad3+野生型未標(biāo)記探針+探針Probe－WT2;組4為核蛋白NPSmad3+anti－Smad3 antibody+ 探針 Probe－WT2。以上4組預(yù)先室溫下孵育 30 min，加入探針Probe－WT2后再孵育30 min，非變性膠預(yù)電泳60 min;然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、交聯(lián);交聯(lián)后的N+帶正電荷尼龍膜按上述同樣的方法處理、檢測、分析結(jié)果。以上兩個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 Smad3過表達(dá)對野生型和突變型Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性影響的觀察

1.4.1 小鼠Amelotin基因啟動子特征性序列定點(diǎn)突變體的構(gòu)建

為將Amelotin基因啟動子序列中(－160～－1)區(qū)域內(nèi)GTCTG定點(diǎn)突變?yōu)镃CCTG，利用突變引物，以質(zhì)粒M5(－160～+196)為模板，按照TaKa-Ra MutanBEST Kit說明進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變質(zhì)粒;然后對突變質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(MluI酶、XhoI酶)和測序鑒定，鑒定正確后命名為MT－M5。

1.4.2 雙熒光素酶報告基因檢測Smad3過表達(dá)時野生型和突變型Amelotin基因啟動子(－160～+196)的轉(zhuǎn)錄活性

pcDNA3.1/Smad3－myc－h(huán)isA 瞬時轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞，并以質(zhì)粒pcDNA3.1/myc－h(huán)isA作為陰性對照、pRL40作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)分為6組(每組復(fù)3孔):組 1為 pGL3－Basic+200 ng pcDNA3.1/myc－h(huán)isA;組2 為 pGL3－Basic+200 ng pcDNA3.1/Smad3－myc－h(huán)isA;組3 為 WT－M5+200 ng pcDNA3.1/myc－h(huán)isA;組 4 為 WT－M5+200 ng pcDNA3.1/Smad3－myc－h(huán)isA;組 5 為 MT－M5+200 ng pcDNA3.1/myc－h(huán)isA;組 6 為 MT－M5+200 ng pcDNA3.1/Smad3－myc－h(huán)isA。轉(zhuǎn)染完成后參照Dual－Luciferase?雙熒光素酶報告基因進(jìn)行檢測，并以每一樣品所測得的數(shù)值U1與U2之比作為該報告基因的相對熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 含不同長度Amelotin基因啟動子片段的熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建及Smad3對Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

通過PCR成功擴(kuò)增了不同長度的Amelotin基因啟動子片段，并通過基因克隆獲得了重組的熒光素酶報告基因載體 M1、M2、M3、M4、M5、M6(圖1a)，測序顯示啟動子序列正確。

將重組的熒光素酶報告基因載體(M1、M2、M3、M4、M5、M6)、pGL3－Basic 分別與 pcDNA3.1、Smad3共同轉(zhuǎn)染小鼠成釉細(xì)胞后，雙熒光素酶報告基因檢測顯示:Smad3 過表達(dá)時，M1、M2、M3、M4、M5的相對熒光素酶活性與對照組(不轉(zhuǎn)染Smad3)相比均顯著增加(P＜0.05)，其中M5增加的幅度最大，約是對照組的2倍;M6與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖1b)。

圖1 Amelotin啟動子的分析

2.2 Smad3和Amelotin基因啟動子特異性結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用

首先，利用Blast軟件分析人和小鼠Amelotin基因啟動子序列(－160～+196)，并發(fā)現(xiàn)這兩個序列在(－160～－1)區(qū)域內(nèi)具有很大的同源性(序列相似性達(dá)到40%以上)。在生物信息軟件分析時發(fā)現(xiàn)，(－140～－136)和(－83～－79)區(qū)域有潛在的Smad3結(jié)合位點(diǎn)(site1、site2)(圖2)。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Smad3可與site2結(jié)合，并存在相互作用(圖3，lane4);而與site1則無結(jié)合(圖3，lane2)。在突變競爭中，可觀察到核蛋白與DNA形成的復(fù)合物(圖3，lane6)，冷競爭中復(fù)合物消失(圖3，lane7);在supershift實(shí)驗(yàn)中復(fù)合物的條帶減弱(圖3，lane8)。以上結(jié)果提示，Smad3與site2之間存在相互作用。

圖2 人和小鼠的Amelotin啟動子DNA序列(－160～+196)的Blast分析(*示兩條基因序列中完全相同的核苷酸堿基)

圖3 觀察Smad3和Amelotin啟動子上Smad3結(jié)合位點(diǎn)1、2之間的相互作用

2.3 Smad3過表達(dá)對野生型和突變型Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

圖4 Smad3對Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響

所構(gòu)建的定點(diǎn)突變的熒光素酶報告基因載體MT－M5經(jīng)酶切、測序結(jié)果顯示，在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生了突變(圖 4a)。瞬時轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－h(huán)isA、pcDNA3.1/Smad3－myc－h(huán)isA及WT－M5、MT－M5后，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與pcDNA3.1/myc－h(huán)isA比較，Smad3轉(zhuǎn)染后，WT－M5比MT－M5的熒光素酶活性顯著增加(P＜0.05);特征性序列定點(diǎn)突變后，Smad3對Amelotin基因啟動子(－160～+196)的轉(zhuǎn)錄活性的影響與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(圖4b)。

3 討論

Amelotin是最近發(fā)現(xiàn)的一種新的牙釉質(zhì)蛋白基因，是成釉細(xì)胞特異性表達(dá)基因之一。有研究顯示，在釉質(zhì)分泌階段，Amelotin基因表達(dá)不明顯，隨著釉質(zhì)發(fā)育成熟，其表達(dá)量增加，提示該蛋白與釉質(zhì)發(fā)育關(guān)系密切［4］。魏亞紅等發(fā)現(xiàn)，隨著釉質(zhì)基質(zhì)的分泌和成釉細(xì)胞發(fā)育的成熟，Amelotin的表達(dá)量增加，提示其在釉質(zhì)發(fā)育后期發(fā)揮重要作用［5］。有學(xué)者認(rèn)為，通過觀察Amelotin基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物，可發(fā)現(xiàn)其釉質(zhì)存在礦化缺陷［6］。另有研究顯示，Smad3基因敲除的小鼠釉質(zhì)也表現(xiàn)為礦化缺陷［2］。以上研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子Smad3和Amelotin均與釉質(zhì)礦化有關(guān)。但對于Amelotin基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的具體分子機(jī)制目前尚不清楚。因此研究在釉質(zhì)礦化過程中Amelotin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已成為一個重要的研究方向。有研究表明，在Amelotin基因啟動子上存在多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Runx2可與Amelotin基因啟動子上相應(yīng)的Runx2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控Amelotin基因的表達(dá)［7］;轉(zhuǎn)錄因子 Smad3 可與Amelotin基因啟動子上相應(yīng)的 Smad3結(jié)合位點(diǎn)(－1418～ －1415)與(－50～ －47)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控Amelotin基因的表達(dá)［1］。在本實(shí)驗(yàn)中，首先，利用軟件對Amelotin基因啟動子序列進(jìn)行全面分析，并構(gòu)建了6個不同長度的Amelotin啟動子的熒光素酶報告基因載體;其次，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測了Smad3對Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，Smad3均能不同程度的增強(qiáng)Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性(與李盼等［1］的研究結(jié)果一致)外，同時還能使Amelotin基因啟動子(熒光素酶報告基因載體M5)的相對熒光素酶活性顯著增強(qiáng)(約是對照組的兩倍)。提示，在Amelotin基因啟動子區(qū)域(－160～－196)內(nèi)可能存在新的Smad3的結(jié)合位點(diǎn)，Smad3可通過與之結(jié)合而調(diào)控Amelotin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。鑒于人和小鼠的牙齒發(fā)育過程相似，有學(xué)者推測兩者的Amelotin基因上游的啟動子序列存在同源部分［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)用生物信息學(xué)軟件對人和小鼠的Amelotin基因啟動子序列(－160～－196)進(jìn)行了同源性分析，并發(fā)現(xiàn)兩條序列在(－160～－1)區(qū)域內(nèi)確實(shí)存在很大的同源性;由此推測，其基因的調(diào)控區(qū)域也主要集中于此，這也是我們進(jìn)一步研究的主要依據(jù)。在此研究的基礎(chǔ)上，我們將Amelotin基因啟動子序列(－160～－196)作為新發(fā)現(xiàn)的啟動子功能性區(qū)域，就Smad3對Amelotin啟動子(－160～－196)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響做了進(jìn)一步的分析。利用生物學(xué)工具對Amelotin啟動子序列進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，該啟動子在(－140～－136)和(－83～－79)區(qū)域有潛在的Smad3結(jié)合位點(diǎn)GTCTG和CAGAC。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Smad3和Amelotin啟動子上特異性結(jié)合位點(diǎn)GTCTG之間存在相互作用，而與CAGAC之間未發(fā)現(xiàn)相互作用。最后，用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將Smad3結(jié)合位點(diǎn)GTCTG突變?yōu)镃CCTG，并構(gòu)建突變型Amelotin基因啟動子熒光素酶報告基因載體，然后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測Smad3對Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示:與對照組相比，Smad3能顯著地增強(qiáng)野生型 Amelotin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;與野生型Amelotin啟動子轉(zhuǎn)錄活性相比，Smad3結(jié)合位點(diǎn)突變可明顯抑制Amelotin啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。以上研究結(jié)果表明，Smad3可與Amelotin啟動子區(qū)域(－140～－136)內(nèi)特征性序列相結(jié)合，并進(jìn)而調(diào)控Amelotin基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建Amelotin基因不同長度啟動子片段的熒光素酶報告基因載體，發(fā)現(xiàn)了Amelotin基因啟動子新的功能性調(diào)控區(qū)域，不僅為進(jìn)一步研究Amelotin基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，而且對于研究Smad3與釉質(zhì)疾病的關(guān)系具有潛在的指導(dǎo)意義。

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