王敬旭，丁祥龍，容明燈，趙紅宇，周 磊

(廣東廣州 510280:1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

激光酸蝕聯(lián)合納米管處理的鈦種植體骨結(jié)合能力的研究

王敬旭1，2，丁祥龍2，容明燈1，趙紅宇1，周 磊1

(廣東廣州 510280:1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·廣東省口腔醫(yī)院;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的:研究激光酸蝕聯(lián)合納米管種植體(LAN)與噴砂酸蝕種植體(SLA)在不同時期骨結(jié)合的差異。方法:取Beagle犬4只，分別在每只犬后腿的左側(cè)脛骨植入4枚LAN處理的鈦種植體(LAN組)，右側(cè)脛骨植入4枚SAL處理的鈦種植體作為對照(SLA組);分別于術(shù)后2、4周各隨機處死2只動物，取出脛骨后，采用EXAKT切磨系統(tǒng)制作含種植體的骨組織切片;通過甲苯胺藍(lán)染色法觀察各種植體的骨結(jié)合情況，并比較兩種不同處理方法的種植體在不同時期骨結(jié)合的差異。結(jié)果:術(shù)后2、4周，LAN組的種植體-骨結(jié)合率(BIC%)、骨面積百分?jǐn)?shù)(BA%)均高于SLA組(P＜0.05)。結(jié)論:激光酸蝕聯(lián)合納米管處理的種植體(LAN)相比噴砂酸蝕處理的種植體(SLA)具有更好的骨結(jié)合效果。

鈦;噴砂;激光;酸蝕;納米管

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):359］

近年來鈦種植技術(shù)已成功應(yīng)用于牙列缺損的修復(fù)，且因其手術(shù)創(chuàng)傷小、修復(fù)效果好，而逐漸取代了傳統(tǒng)的修復(fù)形式。良好的骨結(jié)合是種植體成功修復(fù)的前提，而種植體表面是影響骨結(jié)合的一個重要因素［1］。本研究在激光酸蝕的基礎(chǔ)上，結(jié)合納米管處理的方法制備出激光酸蝕聯(lián)合納米管(Laser/acid/nanotuble Modifying，LAN)表面的種植體，并以經(jīng)典的噴砂酸蝕(Sand Blast and Acid Etching，SLA)表面的種植體作為對照進行研究，以期為尋求更好的種植體表面處理技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 純鈦種植體的制備及其表面粗化處理

取商業(yè)Ⅳ級純鈦(深圳市興宏德金屬有限公司)按要求加工成種植體，其具體參數(shù)為:長7.8 mm、外徑3.5 mm、內(nèi)徑2.0 mm;螺紋為平行的等腰梯形:螺峰寬0.5 mm、高 0.75 mm、螺距 3.0 mm(圖 1)。制備完成的種植體用丙酮清除其表面油污，并經(jīng)超聲蕩洗后，分別采用LAN制備技術(shù)及SLA技術(shù)［2］對其表面進行處理。

圖1 不同表面實驗純鈦種植體的外觀形態(tài)

1.2 實驗動物分組和種植體植入

1.2.1 實驗動物和分組

取450～455日齡普通級、健康雄性Beagle犬［許可證號:SCXK(粵)2009-0009，中山大學(xué)北區(qū)實驗動物中心提供］4只(體質(zhì)量16～17 kg)，經(jīng)質(zhì)量檢測(合格證編號:4400420000000026，高腰市康達實驗動物科技有限公司)合格后，根據(jù)不同觀察周期(2、4周)將其隨機分為2組(n=2)，并按以下方法進行種植體植入。動物手術(shù)及飼養(yǎng)管理均在中山大學(xué)北區(qū)實驗動物中心進行。

1.2.2 種植體植入方法

兩組動物:肌肉注射1.5 mL速眠新10 min后，再將30g/L戊巴比妥鈉按1 mL/kg進行肌肉注射。麻醉成功后，常規(guī)備皮、消毒鋪巾，并在種植區(qū)加必蘭1.7 mL進行局麻。在每只犬后腿的左右脛骨前內(nèi)側(cè)中1/3區(qū)段各做一線性切口(長約10 cm，深達骨面)，并翻黏骨膜瓣;然后按臨床種植程序分別在兩側(cè)脛骨的膝關(guān)節(jié)端骨骺線下5 mm處起始均勻植入4枚兩種不同表面的種植體(左側(cè)為LAN組，右側(cè)為SLA組)，并根據(jù)植入位點從上到下依次記為1～4號。最后分層嚴(yán)密縫合傷口，術(shù)后3d每天肌注青霉素80萬單位。以上操作均由同一位醫(yī)生完成。

1.3 取材和帶種植體的骨片制備

1.3.1 收集種植體標(biāo)本

分別于術(shù)后2、4周處死相應(yīng)組的Beagle犬，切除術(shù)區(qū)皮膚及皮下組織，小心分離出原種植區(qū)并暴露種植體頂部后，用外科骨鋸截取各犬包含有種植體的脛骨上段。清除各脛骨標(biāo)本表面的軟組織，并用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，立即浸泡于40g/L福爾馬林固定液中，置于4℃恒溫冰箱保存48～72 h。

1.3.2 帶種植體骨切片的制備

1.3.2.1 骨組織的前處理

取上述各脛骨段，流水沖洗24 h后，用骨科鋸切割包裹著種植體的骨組織(切割時將脛骨夾固于切片機上)，并使分割的骨組織塊露出少許種植體螺紋，大小為10 mm×10 mm×5 mm。按植入順序?qū)Ω鹘M織塊進行編號標(biāo)記后，用700～1 000 mL/L的乙醇分別進行梯度脫水;然后將各組織塊放入模具中，用甲基丙烯酸甲酯進行浸透包埋(在光固化的包埋機中進行)。

1.3.2.2 組織切片方法

為了確保制作出的骨切片厚度為30 μm，整個過程均采用AW100測量系統(tǒng)(艾卡特，德國)控制。具體制作方法:用粘結(jié)劑將包埋好的各標(biāo)本粘于干潔的載玻片A，并將載玻片A固定在切片機上，分別對載玻片A上的組織塊進行修切;修切至充分顯露一側(cè)的種植體后，取下載玻片A，再將其固定在磨片機上對標(biāo)本表面進行拋光;拋光完成后，用膠水將載玻片B黏合在標(biāo)本的拋光面一側(cè)，使之形成兩側(cè)載玻片中間包埋組織標(biāo)本的雙夾結(jié)構(gòu)，然后再將載玻片A側(cè)固定在切片機上，同時將厚度設(shè)定為150 μm，并采用自動步進的定位裝置控制切割厚度對標(biāo)本進行切割;將切下的帶有厚約150 μm骨切片的載玻片B固定在帶有電子測量控制系統(tǒng)和滾動磨盤裝置的微磨片機上，并使用各級Al2O3、SiC砂紙依次對切片進行打磨，磨至切片厚度為30 μm時，再用細(xì)砂紙依次對切片表面進行拋光。

1.4 骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的測定

取上述制備的所有帶種植體的骨磨片，分別經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，光學(xué)顯微鏡下進行觀察并拍照。然后再用Image-pro Express 6.0圖象分析儀測量各骨磨片中新生骨與種植體接觸面的總長度和埋入骨組織內(nèi)的種植體周圍長度;并計算其種植體-骨結(jié)合率(bone-implant contact，BIC%)和骨面積百分?jǐn)?shù)(Bone area，BA%)。本研究定義BIC為種植體梯形凹槽內(nèi)骨組織與種植體的結(jié)合率;BA定義為種植體梯形凹槽腔內(nèi)的成骨面積，計算公式如下。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS v16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對于單獨效應(yīng)的分析，當(dāng)數(shù)據(jù)滿足方差齊性和正態(tài)性，采用兩獨立樣本t檢驗，若不滿足則采用校正的t檢驗。對于單變量兩因素的數(shù)據(jù)，若滿足方差齊性和正態(tài)性，則采用析因設(shè)計的方差分析。假設(shè)檢驗為雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物術(shù)后狀態(tài)觀察

所有Beagle犬均于術(shù)后1 h內(nèi)蘇醒，未發(fā)生死亡。種植體未出現(xiàn)感染排斥現(xiàn)象，手術(shù)創(chuàng)口均達到Ⅰ期愈合，實驗觀察期間發(fā)現(xiàn)犬有舔舐術(shù)區(qū)現(xiàn)象，但無紅腫及化膿的感染情況發(fā)生。術(shù)后7～10d，皮膚縫線自行脫落;術(shù)后第1周犬活動有所受限，2周后活動恢復(fù)，生活狀況正常。

2.2 種植體骨標(biāo)本的大體觀察

所有標(biāo)本均可見骨組織及纖維組織包裹種植體的頂部，植體無松動，未發(fā)現(xiàn)骨吸收現(xiàn)象。術(shù)后2周時，兩組種植體頂部主要由類骨質(zhì)和軟組織所覆蓋;術(shù)后4周時，兩組種植體頂部主要由疏松的骨質(zhì)所覆蓋，較為成熟的偏淡黃色的骨組織相比2周時明顯增多。

2.3 種植體骨切片的染色觀察

術(shù)后2周時，兩類表面處理的種植體均可見稀疏的新生編織骨充滿種植體梯形骨缺損區(qū)內(nèi)，大部分的新生骨均沿著種植體螺紋斜面從原骨創(chuàng)面向螺紋的底部生長，新生骨處于編織骨狀態(tài)，較為稀疏，其間有少量的血管組織(圖2)。術(shù)后4周時，兩類表面處理的種植體均可見新生骨繼續(xù)沿著種植體的螺紋斜面向種植體表面爬行生長，新生骨的量比2周時明顯增多，且成熟度較高，并可見較為成熟形態(tài)的骨小梁開始在梯形骨缺損區(qū)內(nèi)形成;在兩種種植體的螺紋和斜面的底部均有大量新生骨組織的緊密附著，血管組織也較豐富(圖3)。

圖3 術(shù)后4周時兩類表面處理種植體的骨結(jié)合情況比較(甲苯胺藍(lán)染色，×40)

2.4 各組種植體不同時段的BIC%和BA%數(shù)據(jù)測量分析

兩類表面處理種植體植入術(shù)后2、4周時，LAN組的BIC%、BA%均明顯高于SLA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(表1)。

表1 不同處理種植體表面在術(shù)后不同時間BIC%和BA%比較(±s)

表1 不同處理種植體表面在術(shù)后不同時間BIC%和BA%比較(±s)

組別 n SLA 2周 4周LAN 2周 4周BIC 8 0.13 ±0.007 0.25 ±0.006 0.20 ±0.011 0.47 ±0.015 BA 8 0.18 ±0.019 0.36 ±0.044 0.28 ±0.043 0.48 ±0.038 t-13.813 -39.657 -5.935 -5.931 P≈0.001 ≈0.001 ≈0.001 ≈0.001

3 討論

最近的研究表明:種植體表面的不同處理方法對骨結(jié)合效能的影響主要表現(xiàn)在骨改建的早期，而在2個月后，光滑對照組與實驗組相比則體現(xiàn)不出差別，都能達到良好的骨整合效果［3］。因此，該領(lǐng)域的研究者多選擇8周前的階段做為實驗觀察時段。雖然更早的觀察時間點也可得到不同骨結(jié)合的效果，但易造成對比性不明顯，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。故本實驗采用2、4周做為觀察點，來對比這兩種表面處理方法在骨結(jié)合方面的差異性。

自Branemark教授提出“骨結(jié)合(Osseointegration)”理論［4-5］后，由于沒有有力的直接證據(jù)，在相當(dāng)長的時間內(nèi)，這一觀點無法完全讓人信服;當(dāng)時，人們只能通過取出種植體并去除部分軟硬組織后才能大致觀察分析骨結(jié)合的狀況，但還無法制取理想的骨和金屬聯(lián)合切片。直到Schroeder發(fā)明了一種新的切片技術(shù)，并成功制備了滿意的骨和種植體聯(lián)合切片后，才使骨結(jié)合的理論得到有力的證實。目前，關(guān)于種植體骨結(jié)合的組織學(xué)觀察仍沿用Schroeder的研究方法。

實驗表明［6］:EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)可制作出高質(zhì)量的硬組織切片，并能保持組織和種植體之間的結(jié)構(gòu)形態(tài);采用EXAKT切磨系統(tǒng)設(shè)備制備出的切片厚度可小于20 μm，且厚度均一，在顯微鏡下更容易聚焦。

另有研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞合成和分泌的骨基質(zhì)需經(jīng)過約5～7d的延遲時間，其礦化過程才真正開始;礦化骨與類骨質(zhì)之間不僅有一過渡區(qū)域稱分界帶，還有一條由骨質(zhì)顆粒匯合成的線，稱之為礦化前緣，甲苯胺藍(lán)染色可以清晰顯示出這條位于原骨組織和新生礦化骨基質(zhì)之間的分界線［7］。因本實驗是研究兩種不同表面種植體的早期骨結(jié)合效能，故選擇了甲苯胺藍(lán)染色法。

種植體的表面粗化，不僅可增加其表面張力，促進成骨細(xì)胞的吸附、分化、擴增及界面的早期愈合;同時還能增強軟骨細(xì)胞的分化和擴增。有研究表明:與光滑表面相比，表面粗化的鈦種植體可減少種植體周圍纖維組織的再生，增強牙種植體-骨的連接，從而獲得更大的骨結(jié)合面積及更強的抗剪切能力，使骨結(jié)合更快更廣泛的形成［8］。

噴砂加酸蝕的表面處理是目前種植系統(tǒng)采用最廣泛的表面之一，其良好的生物相容性及促骨結(jié)合能力已獲得公認(rèn)。關(guān)于噴砂加酸蝕處理的鈦表面形貌、表面粗糙度、生物相容性及骨的引導(dǎo)性等方面的研究報道都比較詳盡。激光能提高金屬的耐腐蝕性，并能改善金屬表面的物理性能和力學(xué)性能，是一種非接觸性、高效而干潔的處理方法，與目前主流的微弧氧化、酸蝕、噴砂、噴涂等明顯不同。目前激光蝕刻相關(guān)的處理表面，也有較多的研究，證實了該方法處理的表面具有較好的生物相容性，并能顯著提高種植體的骨扭出力;而激光加酸蝕的表面處理方法，本課題組之前的系列研究表明:以光滑表面的種植體作為對照組時，激光酸蝕表面能獲得比光滑表面更快更好的骨結(jié)合;以噴砂加酸蝕的種植體作為對照組時，激光酸蝕表面與噴砂加酸蝕表面的骨結(jié)合速度及效果沒有顯著差異性，也就是說激光酸蝕表面與噴砂加酸蝕表面均具有同樣優(yōu)良的種植體表面［9］。

在純鈦表面制備二氧化鈦(Ti02)納米管是一種在鈦金屬表面加工出的納米級多孔狀結(jié)構(gòu)，是由大量與材料表面相垂直的納米級管狀結(jié)構(gòu)組成，可有效增加種植體的表面積，并增強其表面性能。Brammer等觀察到納米管可促進牛血管上皮細(xì)胞的伸展、遷移［10］。Oh S等發(fā)現(xiàn)，在具有納米管形貌的材料表面，成骨細(xì)胞的細(xì)胞突可伸到納米管內(nèi)，并可使成骨細(xì)胞的增殖提高 300%～400%［11］。Kubota等發(fā)現(xiàn)，植于大鼠股骨的納米管種植體顯示出優(yōu)良的骨再生效果［12］。以上研究結(jié)果均表明，Ti02納米管結(jié)構(gòu)能促進成骨細(xì)胞在種植材料上的初期黏附、增殖，并可促進骨組織的修復(fù)再生。本結(jié)果也顯示，通過激光酸蝕聯(lián)合納米管處理可提高鈦種植體的表面粗糙度，從而增大了種植體的表面積。

本研究成功的在Beagle犬的脛骨上進行了實驗種植體的植入操作，并采用EXAKT切磨系統(tǒng)制作出了較高質(zhì)量的含種植體的骨組織切片。骨組織學(xué)發(fā)現(xiàn):術(shù)后2周時，LAN組和SLA組種植體均以引導(dǎo)類骨組織的沉積和礦化，4周時已獲得較好的骨結(jié)合效果;特別是激光酸蝕聯(lián)合納米管處理的表面，因其具有良好的生物相容性和生物活性，更有利于種植體的骨結(jié)合，是一種較為理想的表面處理方法。

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Osseointegration effects of laser/acid/nanotube-treated titanium implant surface

WANG Jing-xu*，DING Xiang-long，RONG Ming-deng，ZHAO Hong-yu，ZHOU Lei
(*Center of Oral Implantology，Guangdong Provincial Stomatological Hospital＆the Affiliated Stomatological Hospital of Southern Medical University，Guangzhou 510280，China)

AIM:To compare the osseointegration effects of laser/acid/nanotubes-treated(LAN)and sandblasted/acid-treated(SLA)titanium implant surfaces.METHODS:4 LAN implants were embedded in the left tibial bone of 4 Beagledogs，while 4 SLA implants were embedded in the right tibial bone of thedogs.At 2 and 4 w after operation，2 animals were sacrificed respectively and the tibial bones were taken.Bone ossointegration was observed by histological method.RESULTS:The percentage of bone area(BA)and bone-implant contact(BIC)in LANgroup were significantly higher than those in SLAgroup at both 2 and 4 w(P ＜0.05)after implantation.CONCLUSION:Laser/acid/nanotube-treated implants are more effective for ossoingrationthan than sandblasted/acid-treated implants.

titanium;sandblast;laster;acid;nanotubes

R783.1

A

1005-2593(2015)06-0359-05

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.006

2015-03-15;

2015-04-29

國家自然科學(xué)基金(81170998)

王敬旭(1978-)，男，漢族，河南周口人。博士，副主任醫(yī)師

周 磊，E-mail:zho668@263.com