王 賀，吳補領(lǐng)，段小紅

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物學(xué)教研室，陜西西安 710032)

小鼠牙囊細胞體外培養(yǎng)方法與形態(tài)特征探討

王 賀1，2，吳補領(lǐng)1，段小紅2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510515;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物學(xué)教研室，陜西西安 710032)

目的:探討小鼠牙囊細胞的體外培養(yǎng)方法并觀察其形態(tài)特征。方法:體視顯微鏡下分離出生3～5d仔鼠牙胚，用I型膠原酶消化后分離牙囊組織，采用酶消化－組織塊法和二次酶消化法進行牙囊細胞的原代及傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果:酶消化－組織塊法經(jīng)4～5d，部分組織塊周圍見細胞呈放射狀爬出，2周后細胞集落仍難以匯合，無法傳代。二次酶消化法第2天可見散在細胞集落形成，4～5d細胞接觸匯合。傳代發(fā)現(xiàn)，多角形細胞消失，第2代后梭形細胞占大多數(shù)，第3代細胞生長速度最快，第4代細胞增殖速度減慢，第5代后細胞趨于靜止;隨著傳代次數(shù)的增加胞體逐漸增大，可出現(xiàn)一些樹突形細胞。結(jié)論:采用二次酶消化法進行小鼠牙囊細胞原代培養(yǎng)可在短時間內(nèi)獲得較多的細胞，操作簡便且成功率高，細胞形態(tài)隨培養(yǎng)時間而變化多樣。

小鼠牙囊細胞;二次酶消化法;細胞培養(yǎng);方法學(xué)

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25(6):370］

牙囊(Dental follicle，DF)起源于外胚間充質(zhì)，是包繞在成釉器周圍和牙乳頭底部呈囊狀排列的結(jié)締組織，其在牙齒萌出后期可形成牙骨質(zhì)、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需條件之一［1］，并在組織、細胞和分子等多個水平上調(diào)控牙齒的萌出［2－3］。Wise 等［4］(1992)首次報道了采用改良組織塊酶消化法進行大鼠牙囊細胞的體外培養(yǎng)，凌均棨等［5－6］、葉國［7］、劉曉輝等［8］也采用不同或類似的方法先后進行了大鼠牙囊細胞體外培養(yǎng)并取得成功。而小鼠牙囊細胞的原代分離培養(yǎng)僅有葛少華等［9－10］采用改良組織塊培養(yǎng)法獲得成功，國外尚未見相關(guān)報道。小鼠作為應(yīng)用最廣泛的模式動物之一，在牙萌出領(lǐng)域的研究中具有其他動物無法比擬的優(yōu)勢。但小鼠牙囊細胞的分離培養(yǎng)卻較其他動物困難，大大限制了其應(yīng)用范圍。本實驗通過比較酶消化－組織塊法和二次酶消化法在小鼠牙囊細胞原代培養(yǎng)中的優(yōu)缺點，以期為進一步研究牙囊細胞的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器和實驗動物

α－MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco，美國);I型膠原酶(Sigma，美國);EDTA、青霉素、鏈霉素(西安科昊生物);丙酮酸鈉(北京中生瑞泰);PBS(西安國安生物);細胞培養(yǎng)板(廣州潔特);低速離心機(長沙湘儀);溫控水浴機(上海精宏);超凈工作臺(Airtech，蘇凈安泰);細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，美國);倒置相差顯微鏡(Leica，德國);Balb/c仔鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。

1.2 牙囊組織的分離和獲取

參考Wise等［4］報道的方法并進行改進。取6只出生3～5d的Balb/c仔鼠，分別經(jīng)脫頸法處死，750 mL/L乙醇浸泡消毒1 min后，外科法分離出完整下頜骨，并置于預(yù)冷的PBS(含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)中。體視顯微鏡下剝離牙胚周圍的骨組織，分離出各小鼠的下頜第一磨牙和第二磨牙牙胚，并置于預(yù)冷的α－MEM培養(yǎng)基中。收集所有牙胚置于200 μL(2g/L)I型膠原酶消化液中，37℃水浴20 min后，將牙胚轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的α－MEM培養(yǎng)基中;然后在體視顯微鏡下分離牙囊和成釉器，并將剝離出的牙囊組織立即置于預(yù)冷的α－MEM培養(yǎng)基中待用。

1.3 牙囊細胞的原代培養(yǎng)

1.3.1 酶消化－組織塊法

取上述方法獲得的牙囊組織，分散成小塊后以0.5 cm的間距直接接種于24孔板，放置2～5 min待組織塊稍干并貼壁后，每孔加入含胎牛血清(200 mg/L)、丙酮酸鈉 (0.1g/L)、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的 α －MEM 培養(yǎng)基各 500 μL(注意避免組織塊浮起)，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。次日輕吹懸浮未貼壁組織塊，并用預(yù)溫的培養(yǎng)基進行半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察;此后每2d半量換液1次，并嚴密觀察細胞的狀態(tài)，待細胞生長接近80%匯合時進行傳代。

1.3.2 二次酶消化法

取上述獲得的牙囊組織，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊后，置于 500 μL(2g/L)Ⅰ型膠原酶消化液中，37℃水浴1 h，消化期間每10 min振蕩1次懸浮組織。消化結(jié)束后，200目篩網(wǎng)過濾細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清;沉淀部分用1 mL α－MEM培養(yǎng)基(配方同1.3.1)重懸后，接種于 24孔板，置于37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。次日輕吹懸浮未貼壁細胞，并用預(yù)溫的培養(yǎng)基進行半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察。此后每2d半量換液1次，待細胞生長接近80%匯合時，則進行傳代。

1.4 牙囊細胞的傳代培養(yǎng)和分離純化

在上述原代培養(yǎng)中，酶消化－組織塊法培養(yǎng)共進行29次，二次酶消化法培養(yǎng)共進行32次。傳代時均加入2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA復(fù)合消化液，并置于37℃下消化8～20 min;當顯微鏡下觀察到大部分細胞胞體收縮變圓，且部分細胞懸浮時，加入含血清的α－MEM培養(yǎng)基終止消化，并反復(fù)吹打20次(吹打過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡)。然后收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清;沉淀的細胞用新鮮培養(yǎng)基重懸后，1∶2傳代培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與原代培養(yǎng)相同)。

1.5 倒置相差顯微鏡觀察牙囊細胞

倒置相差顯微鏡下觀察不同生長階段細胞，拍照前4 h輕吹懸浮死亡細胞，然后更換預(yù)溫新鮮培養(yǎng)基，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出并拍照。

2 結(jié)果

2.1 牙囊細胞

酶消化－組織塊法培養(yǎng)的牙囊細胞，24～48 h小部分組織塊見細胞爬出，呈貼壁生長，第3～5天時爬出的細胞數(shù)量逐漸增多，成暈環(huán)狀。細胞呈多突起的梭形和多角形，細胞核較大且位于中央，呈圓形或卵圓形。

二次酶消化法培養(yǎng)的牙囊細胞，培養(yǎng)基底部混雜大量組織碎屑，24 h后散在細胞集落生成，大小不均。細胞呈放射狀或漩渦狀生長，為典型的成纖維細胞。4～5d時細胞集落融合，鋪滿板底。細胞為多突起的梭形和多角形兩種細胞群體，形態(tài)混雜且生長界限不清(圖1a)。

2.2 細胞的傳代和純化

酶消化－組織塊法體外培養(yǎng)10～14d后，細胞生長較為密集，傳代消化發(fā)現(xiàn)，細胞貼壁牢固，加入消化液20 min后大部分胞體收縮變圓，細胞間隙變大、分離。常規(guī)中止消化、吹打、離心、重懸后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。傳代細胞貼壁后生長幾乎停滯，因長時間培養(yǎng)使細胞逐漸老化，無法生長匯合至實驗所需的細胞量。

二次酶消化法培養(yǎng)4～5d細胞生長接近匯合后，加入消化液5～8 min后大部分胞體收縮變圓，細胞間隙變大、分離。常規(guī)中止消化、吹打、離心、重懸后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。12 h后細胞恢復(fù)形態(tài)并貼壁生長，大部分呈梭形，多角形細胞比例減少(圖1b)。首次傳代后，細胞生長速度加快，3～4d可再次傳代。第3代細胞生長速度最快，2～3d時數(shù)量倍增，大小一致、胞體較豐滿、立體感強、呈多形型，多角形細胞基本消失(圖1c)。第4代細胞生長速度明顯下降，細胞表面積變大，形態(tài)異型性明顯，胞體趨于扁平，含2個胞核的細胞增多。第5代細胞生長接近停滯，表面積和形態(tài)變化、細胞間差異更為明顯(圖1d)。2.3 兩種培養(yǎng)方法的比較

酶消化－組織塊法培養(yǎng)進行29次，二次酶消化法培養(yǎng)33次，培養(yǎng)過程中前者污染4次(13.8%)，后者污染 5 次(15.2%)。除去污染的樣本，酶消化－組織塊法:有6次培養(yǎng)的細胞群落生長至板底50%(表面積)，占20.7%，傳代后未出現(xiàn)細胞匯合，無法繼續(xù)傳代培養(yǎng);二次酶消化法:原代培養(yǎng)4～5d均達到80%匯合率且能順利傳代，成功率100%。

圖1 倒置相差顯微鏡下不同培養(yǎng)代數(shù)小鼠牙囊細胞的形態(tài)特征(白色箭頭示細胞突起，×100)

3 討論

牙囊在牙萌出時期占據(jù)的天然重要位點使其在調(diào)節(jié)破骨和成骨平衡、牙槽骨活性、牙萌出發(fā)揮重要作用［11］，牙囊通過在時間和空間上調(diào)節(jié)重要基因的表達，調(diào)節(jié)破骨細胞形成和骨生成［3］。無論是研究牙囊的多向分化［12］、牙周再生組織工程［13］還是牙萌出相關(guān)因子的作用［14］，都需要以牙囊細胞成功的體外分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)。

以往的研究者多使用大鼠［4，15］牙囊細胞作為動物取材對象，培養(yǎng)方法涉及組織塊法、酶消化－組織塊法、酶消化法等(圖2)。小鼠牙囊細胞體外培養(yǎng)較少，葛少華等［9］曾采用酶消化－組織塊法獲取原代培養(yǎng)小鼠牙囊細胞;Zhao M等嘗試使用SV40［16］、HPV16 E6［17］等使小鼠牙囊細胞永生化，雖然此方法可獲得充足的細胞量以方便研究，但永生化的牙囊細胞特異表型可能會發(fā)生一定的改變。

關(guān)于牙囊細胞的培養(yǎng)方法命名報道各異，較不統(tǒng)一，如改良組織塊法、酶消化細胞分散法、牙囊直接剝離法和膠原酶－胰酶交替消化法等，不利于各研究結(jié)果之間的橫向比較。本文基于國內(nèi)外相關(guān)文獻，從取材動物、牙囊的分離方法、牙囊細胞獲取和接種特點等，將牙囊細胞的體外培養(yǎng)方法歸為6類:酶消化－組織塊法、二次酶消化法、二次酶消化－組織塊法、酶消化法、組織塊法、組織塊－酶消化法(圖2)。其核心步驟包括:①牙囊組織通過機械剝離還是酶消化后剝離;②剝離后的牙囊組織按組織塊法還是酶消化法離散后接種。

圖2 小鼠和大鼠牙囊細胞不同體外分離培養(yǎng)方法及流程

1992年以來，國內(nèi)外不同學(xué)者采用不同或類似的方法進行大鼠牙囊細胞的分離培養(yǎng)，并獲得了較高的成功率。大鼠牙胚較大，可不經(jīng)過酶消化從其表面直接剝離牙囊組織;小鼠牙胚細小，不經(jīng)過消化處理難以將牙囊組織從成釉器表面剝離;由于小鼠牙囊組織量少，難以獲得足夠多的組織進行接種，并且細胞在傳代后不易生長。本實驗將小鼠牙囊細胞的酶消化－組織塊法和二次酶消化法進行了對比驗證。胰蛋白酶能選擇性地水解由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，使細胞間的蛋白質(zhì)水解而使細胞離散，其作用力強、消化程度不易掌握，本實驗采用作用于細胞外基質(zhì)膠原蛋白、效力柔和的I型膠原酶消化牙胚獲取牙囊組織及后期的細胞分離。本結(jié)果顯示，二次酶消化法更易于獲得足夠的細胞，并且還具有操作簡便、成功率高、所需時間短等優(yōu)點。采用二次酶消化法10d左右可得到第3代細胞，細胞量從1個24孔板孔可擴增到1個6孔板孔(而采用酶消化－組織塊法一般需10～14d方能進行首次傳代)，此時細胞為較均質(zhì)的群體，狀態(tài)穩(wěn)定，便于開展各項研究。

通過本實驗及回顧文獻，我們將體外培養(yǎng)牙囊細胞的形態(tài)歸為4類(表1)。在細胞培養(yǎng)初期，多角形與梭形細胞并存，隨著細胞傳代次數(shù)的增加，多角形細胞減少，梭形細胞增多，后期可出現(xiàn)一些樹突形或水滴形的細胞。本實驗結(jié)果提示，小鼠牙囊細胞在原代培養(yǎng)和生長密度較高的時候才會呈現(xiàn)出規(guī)則的梭形或紡錘形(圖1b)，傳代后普通密度體外培養(yǎng)時為多突起的不規(guī)則樹突狀或水滴狀(圖1c)。推測牙囊細胞豐富多樣的細胞突起可能與其旺盛的分泌功能有關(guān)［18］。牙囊細胞是一種異質(zhì)性的細胞群體［18］，可能是導(dǎo)致細胞外在形態(tài)差異的原因.因此我們認為，細胞的接種密度、傳代次數(shù)在很大程度上影響體外培養(yǎng)的牙囊細胞形態(tài)。第4代以后細胞形態(tài)逐漸發(fā)生較大變化，因此建議應(yīng)選用狀態(tài)最佳的第3代小鼠牙囊細胞進行各類實驗。

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Exploration of culture method and morphological characteristics of mousedental follicle cells in vitro

WANG He*，WU Bu－ling，DUAN Xiao－h(huán)ong
(*Nanfang Hospital，Southern Medical University，College of Stomatology，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China)

AIM:To explore the culture method of mousedental follicle cells(DFCs)in vitro and to observe their morphological characteristics.METHODS:Dentalgerms from 3－5days postnatal mice weredigested with type I collagenase and thedental follicle tissues weredissected by enzyme isolation－tissue explant and twice－enzyme isolation.The morphology of the cultureddFCs was observed under inverted microscope.RESULTS:At the 4 th－5 thday in vitro，several cells were extended from part of the tissue explants and were hardly to fuse even after 2 weeks'culture.The method of enzyme isolation－tissue explant was failed because of unable to passage and amplify the cells while the method of twice－enzyme isolationgot a success rate of about 85%.Scatteredgroups of cells were seen at the secondday and they fused at the 4 th－5 thday in vitro by way of twice－enzyme isolation.Polygonal and spindle cell populations coexisted in primary culture.Almost all polygonal cellsdisappeared in subculture，and spindle cells became the majority of cell population.The cells of third passagegrew fastest，then sloweddown and tended to stop in the fourth and fifth passage，respectively.After several times of passage，the cells became larger and polymorphic in shape，somedendrite －like cells were observed.CONCLUSION:The method of twice－enzyme isolation may havest considerable cells in a short time with a high success rate.Morphology ofdFCs is changed with the culture time and is multiple.

mousedental follicle cells;twice－enzyme isolation;cell culture;methodology

R780.2

B

1005－2593(2015)06－0370－05

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.06.009

2014－11－04

國家自然科學(xué)基金(81271116)

王 賀(1990－)，男，漢族，廣東揭陽人。碩士生(導(dǎo)師:吳補領(lǐng)，段小紅)

吳補領(lǐng)，E －mail:bulingwu@smu.edu.cn

段小紅，E －mail:xhduan@fmmu.edu.cn