閔 曦，夏 榮，孫 磊，徐基亮，孫子環(huán)

鈦及鈦合金因具有良好的生物相容性被廣泛運(yùn)用于骨種植領(lǐng)域。圍繞骨種植體表面的納米化改性作為提高種植體骨整合能力的有效手段被廣泛研究。研究［1］證實(shí)運(yùn)用陽極氧化法在鈦表面制備出三維有序的TiO2納米管，提高了種植體表面生物學(xué)活性。鈦表面隨時(shí)間增加而出現(xiàn)生物活性降低的現(xiàn)象被稱為鈦老化［2］。紫外光照射可引發(fā)TiO2表面光催化反應(yīng)，分解表面有機(jī)物，提高材料親水性［3］。該研究對充分老化的TiO2納米管表面進(jìn)行紫外光照射，通過對表面元素含量及接觸角的分析探討照射前后材料表面理化性質(zhì)的改變，并評價(jià)不同表面對小鼠骨髓未分化間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)黏附、增殖、分化的影響，為延緩并提高老化鈦表面生物活性提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料 商業(yè)純鈦片直徑為12 mm，厚度為0.25 mm，純度99.99%(北京中金研新材料科技有限公司);碳化硅金相砂紙(蘇州百威拋光材料有限公司);丙酮(北京化學(xué)試劑廠);乙二醇(上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氟化銨(國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司);MSCs(上海晶曠生物科技有限公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);CCK-8細(xì)胞增殖－毒性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);0.1%Triton X-100細(xì)胞裂解液(上海君瑞生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 主要儀器 場發(fā)射掃描電鏡(FESEM，美國FEI公司);X射線光電子能譜(XPS，美國Thermo公司);SL200B接觸角檢測儀(上海梭倫信息科技有限公司);KQ-400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);KD-BN高精密電子天平(福州科迪電子技術(shù)有限公司);生物安全柜(蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司);二氧化碳孵育箱(美國Thermo公司);WD 72倒置顯微鏡(日本O-lympus公司);HDL-4數(shù)顯醫(yī)用離心機(jī)(深圳瑞鑫達(dá)科教儀器有限公司);酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)。15 W紫外光滅菌燈(荷蘭Philips公司)

1.2 方法

1.2.1 鈦片拋光及TiO2納米管的制備 鈦試件經(jīng)800#～7000#碳化硅金相砂紙逐級打磨拋光至鏡面效果。丙酮、無水乙醇、去離子水依次超聲清洗15 min。取 1.5 g 氟化銨、450 ml乙二醇、50 ml去離子水配置電解液。采用自制電解槽，以石墨為陰極，實(shí)驗(yàn)鈦片為陽極，調(diào)整電壓為60 V，陽極氧化2.5 h。取出鈦試件，去離子水超聲振蕩15 min，去除表面氧化膜。再次以12 V電壓陽極氧化40 min，去離子水清洗，干燥備用。

1.2.2 試件保存、紫外光照射及實(shí)驗(yàn)分組 將兩步陽極氧化后的鈦試件置于暗盒內(nèi)，自然環(huán)境下避光保存8周。取出部分鈦片暗室內(nèi)以15 W紫外線滅菌燈(ultraviolet，UV)照射 48 h，照射距離 15 cm。將陽極氧化后直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的鈦片設(shè)為新鮮組，避光保存8周后的鈦片設(shè)為老化組，老化組鈦片經(jīng)紫外光照射后設(shè)為UV組。

1.2.3 表面形貌及元素分析 新鮮組、老化組和UV組每組各選取3枚試件在FESEM下觀察表面微觀形貌;采用XPS分析各組試件表面的化學(xué)元素組成。

1.2.4 親水性檢測 每組各選取3枚鈦片，每個(gè)鈦片隨機(jī)選取3個(gè)測試點(diǎn)，以1 μl去離子水滴于試件表面，待水滴完全鋪展后利用接觸角測量儀成像系統(tǒng)及軟件測量表面接觸角，結(jié)果取平均數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及試件滅菌 37℃水浴復(fù)蘇第6代MSCs，配置完全培養(yǎng)基。37℃、5%CO2條件下孵育細(xì)胞，定期更換培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞鋪展到80%時(shí)傳代。用于細(xì)胞培養(yǎng)的鈦試件經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后備用。

1.2.6 細(xì)胞黏附觀察 將滅菌后的鈦片置于24孔板內(nèi)，取培養(yǎng)瓶內(nèi)對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化后重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至6×104/ml，500 μl/孔接種于各試件表面。常規(guī)培養(yǎng)24 h后吸除原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)清洗3次，2.5%戊二醛固定，干燥后噴金。FESEM下觀察細(xì)胞黏附狀況。

1.2.7 細(xì)胞增殖情況檢測 同1.2.6方法將細(xì)胞懸液注入置有鈦片(每組3片)的24孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)。分別于第1、3、5、7天終止培養(yǎng)，吸去原有培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，每孔加入200 μl完全培養(yǎng)基、20 μl CCK-8，37℃孵育4 h至培養(yǎng)基變色，吸取每孔110 μl液體轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔吸光度(OD450)值。

1.2.8 細(xì)胞分化檢測 同1.2.6方法常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。分別于第3、5、7、11天終止培養(yǎng)，吸去原培養(yǎng)液，PBS反復(fù)清洗3次，每孔加入300 μl 0.1%Triton X-100裂解液，裂解細(xì)胞30 min后，取50 μl細(xì)胞裂解液置于新24孔板內(nèi)。按AKP檢測試劑盒操作說明，分別加入 500 μl基質(zhì)液、500 μl緩沖液混勻，37℃水浴15 min后，加入1.5 ml顯色液搖勻，測定450 nm各孔的OD450值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對接觸角、不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用SNK檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)雙側(cè)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 表面形貌分析 FESEM下觀察兩步陽極氧化后鈦表面TiO2納米管形態(tài)，呈內(nèi)外管相套的蜂窩狀排列，陣列排列有序，外管直徑為160 nm，內(nèi)管直徑為20 nm，見圖1。新鮮組、UV組鈦表面納米管形態(tài)無明顯改變。老化組納米管邊界模糊，部分管徑變窄。

2.2 表面化學(xué)元素分析 XPS結(jié)果顯示，3組鈦表面元素成分均包含Ti、C、O、N和F。老化組表面C元素含量顯著增高，可能來自于環(huán)境中的碳?xì)浠衔镂廴?。UV組C元素含量顯著降低，接近新鮮組水平。見圖2。

2.3 表面接觸角分析 3組表面靜態(tài)接觸角檢測結(jié)果:新鮮組(22.956 00±4.202 62)°，呈親水性;老化組(116.630 00±11.615 00)°，呈疏水性;UV組(3.798 00±1.087 45)°，呈超親水性，見圖3。各組間接觸角數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.4 細(xì)胞黏附 3組鈦片 MSCs培養(yǎng)24 h后，F(xiàn)ESEM下觀察均有細(xì)胞黏附，新鮮組細(xì)胞鋪展較開，密度較高，形態(tài)大部分呈梭形，有偽足伸出。老化組細(xì)胞密度明顯低于新鮮組，大部分細(xì)胞呈圓團(tuán)形。UV組細(xì)胞密度較老化組明顯提高，鋪展良好，細(xì)胞間接觸多于新鮮組。見圖4。

2.5 細(xì)胞增殖 試件接種后第1、3、5、7天增殖活性均呈現(xiàn)增長趨勢，UV組增殖活性更加明顯?？傮w比較第1天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，接種第3、5、7天后3組總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SNK法比較顯示，在同時(shí)間點(diǎn)，除第1天組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

2.6 細(xì)胞分化 3組在不同時(shí)點(diǎn)AKP活力均有增加的趨勢，同時(shí)點(diǎn)上總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SNK法兩兩比較顯示，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

3 討論

種植體的表面形貌是影響其植入后骨整合的速度和程度的重要因素之一。具有納米級表面形貌的種植體被認(rèn)為更具有仿生效果［4］，可促進(jìn)與成骨細(xì)胞間的相互作用，有利于成骨。常見的種植體表面納米改性包括納米顆粒、納米管、納米涂層等［5－6］。TiO2納米管與鈦表面結(jié)合強(qiáng)度高，陣列有序且具有較高的表面積和吸附能力。陽極氧化法是制備鈦基表面TiO2納米管的有效方法之一，通過調(diào)整電解液成分、電壓和時(shí)間等參數(shù)可獲得不同管徑和結(jié)構(gòu)的TiO2納米管形態(tài)［7］。本研究采用的兩步陽極氧化法獲得雙層蜂窩狀TiO2納米管矩陣列，排列均勻，結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，可避免納米管面積過大造成的崩塌。

鈦種植體從生產(chǎn)加工到植入患者體內(nèi)有較長的時(shí)間間隔，因?yàn)榇娣怒h(huán)境和時(shí)間的不同可造成種植體表面理化性質(zhì)及生物相容性變化，直接影響植入后的骨整合能力。研究［8］表明，時(shí)間因素會(huì)導(dǎo)致鈦表面的老化，其原因可能為鈦表面受到來自環(huán)境中的不可避免的碳?xì)浠衔镂廴尽?/p>

親水性作為材料表面能的重要表征之一，影響材料表面的生物活性。研究［9］顯示材料表面接觸角＞65°為疏水性，＜65°為親水性，＜5°則為超親水性表面，表明親水性高的材料表面有利于體液中蛋白質(zhì)的吸附，進(jìn)而影響細(xì)胞的行為和功能。TiO2的光催化作用被廣泛研究，用于水質(zhì)凈化、大氣治污、材料表面自潔等領(lǐng)域。Wangetal［10］證實(shí)用波長＞387.5 nm的紫外光照射TiO2表面可產(chǎn)生超親水性。TiO2光催化作用的實(shí)質(zhì)是光誘導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)，作為半導(dǎo)體材料，當(dāng)光能量＞3.2 eV時(shí)，TiO2表面會(huì)產(chǎn)生光催化作用，使價(jià)帶上的電子躍遷到導(dǎo)帶上形成具有強(qiáng)的氧化能力的羥基、氧自由基等活性基團(tuán)，使TiO2表面的碳氧化合物分解成CO2和H2O［11］。TiO2光催化作用受 TiO2晶體結(jié)構(gòu)、管徑大小、紫外光的波長及照射時(shí)間等諸多因素影響［12］。TiO2管徑越小、紫外光波長越短、照射時(shí)間越長光催化效果越好。本實(shí)驗(yàn)采用的雙層TiO2納米管結(jié)構(gòu)，內(nèi)管直徑約20 nm;15 W紫外線滅菌燈波長在200～275 nm，屬于短波紫外光波段;照射48 h后，XPS結(jié)果顯示老化組鈦表面 C元素含量由39%降至19%，與新鮮組持平，表明紫外光催化可有效分解鈦表面的碳?xì)浠衔镂廴?。平均接觸角顯示紫外光照射后的鈦表面呈超親水性。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)紫外光催化后的鈦表面細(xì)胞的黏附、鋪展、增殖、分化等指標(biāo)均優(yōu)于老化組和新鮮組。證實(shí)了紫外光催化作用有助于提高納米TiO2表面的生物活性。

表13 組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖活性比較(n=36，±s)

表13 組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖活性比較(n=36，±s)

與新鮮組比較:＊＊P＜0.01;與老化組比較:##P＜0.01

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表23 組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞分化比較(n=36，±s)

表23 組間不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞分化比較(n=36，±s)

與新鮮組比較:＊＊P＜0.01;與老化組比較:##P＜0.01

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