劉坤洋

瓊脂擴散試驗包括瓊脂雙向單擴散試驗和瓊脂雙向雙擴散試驗，后者是最常用的瓊脂擴散試驗，一般用于抗體或抗原的定性檢測，其原理是可溶性抗原與相應(yīng)的抗體（抗血清）在瓊脂凝膠中向四周自由擴散，如果抗原和抗體相對應(yīng)，則在二者比例適當(dāng)處形成肉眼可見的白色沉淀線，反之則不會出現(xiàn)沉淀線。常用已知抗原檢測未知的血清樣本，也可用已知抗血清檢測未知抗原樣本。

1 瓊脂擴散試驗的影響因素

1.1 瓊脂板的制備

瓊脂板的質(zhì)量、濃度、黏度、厚度、濕度等都會影響瓊脂擴散試驗的結(jié)果，瓊脂濃度越低，則孔徑越大，擴散速度也會越快；如果瓊脂濃度越大，那么瓊脂的黏度也會隨之增大，擴散速度會相對減慢，建議使用較好的瓊脂（瓊脂糖），最適濃度為1%，厚度約2.5毫米，注意倒熱融化瓊脂液時不要產(chǎn)生氣泡，而且空氣中的濕度很低，瓊脂中的水分容易蒸發(fā)，待瓊脂冷凝后加蓋，把平皿倒置，放在裝有濕紗布的搪瓷盤中，防止水分蒸發(fā)，保證濕度。

1.2 打孔

打孔是瓊脂擴散試驗中的關(guān)鍵，反應(yīng)孔應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)打，放在4℃冰箱中過夜后再使用。實驗室常用梅花打孔器，然后用針頭挑出內(nèi)容物。用此種方法在打孔的過程中，注意挑出空內(nèi)容物時避免將凝膠劃破，否則可造成孔與孔之間產(chǎn)生裂痕，產(chǎn)生錯誤的實驗結(jié)果。如果試驗檢測的樣品數(shù)量不是很多，還可以將若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷卻的熱融化瓊脂液，之后迅速并平穩(wěn)地放入4℃冰箱中，冷卻后取出平皿，逐個輕輕拔出打孔器，根據(jù)實驗需要重復(fù)此操作。打孔后用酒精燈輕烤平皿底部進行封底時，在酒精燈上來回幾次，以平皿不燙手（微熱即可）為宜，若是塑料平皿要注意烤的時間不要過長，以免變形，待瓊脂剛剛?cè)诨癁橹?，防止瓊脂板與平皿底部脫離導(dǎo)致陽性血清、被檢血清及抗原相互串通，避免出現(xiàn)模糊的沉淀環(huán)，影響實驗結(jié)果。

1.3 加樣

在加樣之前，首先在瓊脂板上標(biāo)記好實驗日期及樣品編號，加樣過程中小心謹(jǐn)慎，每個樣品加完后都要換槍頭，避免產(chǎn)生小氣泡，需要注意的是每孔會因受人工操作的影響在封底時各孔的容積不同，在加樣時注意不要讓樣品溢出導(dǎo)致液體混合。如果大批量檢測樣品，必須將被檢血清、陽性血清和抗原先后加入一個梅花孔后再加入下一個梅花孔，防止加入的時間間隔太長而擴散的時間不同進而影響抗原抗體結(jié)合及沉淀線的產(chǎn)生。

1.4 判定結(jié)果

當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和抗原孔之間只有一條明顯致密線時，被檢血清與抗原孔形成沉淀線，或陽性血清的沉淀線向相鄰的被檢血清的抗原側(cè)偏彎，則被檢血清為陽性。如果被檢血清沒有出現(xiàn)任何沉淀帶，或出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照沉淀帶完全交叉者判為陰性。觀察時需借助強光源，調(diào)整角度、方位直到陽性血清和抗原孔之間出現(xiàn)清晰白色沉淀線則試驗成立，否則應(yīng)重做。

2 注意事項

2.1 溫度

溫度對整個試驗也會有影響，制備瓊脂板時融化瓊脂時需在水浴中進行，注意防止在加熱過程中由于水分的蒸發(fā)而影響溶液的濃度，在瓊脂中加入0.01%的硫柳汞防止細(xì)菌污染，避免腐敗。在一定條件下，溫度越高擴散越快，通常反應(yīng)在0～37℃下進行，在試驗中為保證沉淀線清晰度防止沉淀線變形，可在37℃下形成沉淀線，然后置于4℃條件下。

2.2 時間

擴散時注意時間，時間過短不能出現(xiàn)沉淀線，時間太長會導(dǎo)致沉淀線解離或散開出現(xiàn)假陰性而影響實驗結(jié)果，沉淀線的形成一般在24小時、48小時、72小時觀察并記錄，過久會出現(xiàn)沉淀線消失。

2.3 其他因素

不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、打孔時孔型不規(guī)則、邊緣開裂、孔底滲漏、抗原抗體濃度不同、孵育時平皿未放平等等，所以在做瓊脂擴散試驗時一定要設(shè)立對照，以免出現(xiàn)假陽性。