陶曉薇毛其芬

槲皮素對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G凋亡及HSP27蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

陶曉薇1毛其芬2

目的 探討天然藥物槲皮素對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物效應(yīng)及機(jī)制。方法 采用槲皮素治療人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G，MTT法檢測(cè)治療后T98G細(xì)胞的增殖抑制情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)槲皮素治療后T98G細(xì)胞的凋亡情況，并用Western blot檢測(cè)細(xì)胞活化caspase-3（cleaved caspase-3）的表達(dá)和熱休克蛋白27（HSP27）的表達(dá)；將T98G細(xì)胞的HSP27基因用特異性HSP27 siRNA沉默后再用槲皮素治療，檢測(cè)槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果 對(duì)照組及5μM、25μM、50μM、100μM、200μM槲皮素組對(duì)T98G細(xì)胞的48h增殖抑制率分別為0、（0.05± 0.02）%、（21.8±3.4）%、（42.2±5.7）%、（67.6±6.8）%、（76.9±7.0）%，各濃度槲皮素組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組及25μM、50μM、100μM槲皮素組對(duì)T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率分別為（0.8±0.3）%、（4.9±0.6）%、（8.1±0.9）%、（21.5±1.7）%，各濃度槲皮素組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組及25μM、50μM、100μM槲皮素組T98G細(xì)胞caspase-3活性分別為（0.01±0.01）、（0.05±0.03）、（0.12±0.03）、（0.22±0.05），50μM、100μM槲皮素組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HSP27活性分別為（0.84±0.12）、（0.75±0.11）、（0.52±0.08）、（0.37±0.06），50μM、100μM槲皮素組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 槲皮素有良好的抗神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物活性，其抗腫瘤機(jī)制可能和下調(diào)HSP27蛋白有關(guān)。

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；槲皮素；T98G；HSP27；凋亡；caspase-3

神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦癌，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過(guò)擴(kuò)散、滲透入侵正常腦組織，使患者無(wú)法進(jìn)行腫瘤組織全切除手術(shù)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大多數(shù)被確診為神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的患者，盡管接受了包括手術(shù)、放療、化療等常規(guī)治療措施，其生存周期仍短于一年[2]，尋找新的治療方法無(wú)疑十分重要。和其它的一些惡性腫瘤相似，人腦癌細(xì)胞高度表達(dá)熱休克蛋白27（HSP27）[3]。HSP27的高度表達(dá)能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，更為重要的是，HSP27蛋白能保護(hù)細(xì)胞逃避凋亡這一大多數(shù)抗腫瘤藥物的效應(yīng)靶點(diǎn)[4]。槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜、谷物中的天然黃酮類(lèi)化合物,有很好的抗氧化和抗炎作用，近年研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能激活腫瘤細(xì)胞的凋亡通路，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。槲皮素對(duì)腦癌的抗腫瘤效應(yīng)及其機(jī)制少見(jiàn)報(bào)道。本研究探討槲皮素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G細(xì)胞系來(lái)源于美國(guó)ATCC（產(chǎn)品號(hào)：CRL-1690），培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，100U/L青霉素和100mg/ mL鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫，通入5%的CO2。

1.2 試 劑 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司。槲皮素、二甲亞砜、噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于Sigma-Aldrich。PI/ AnnexinⅤ凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)ebioscience?；罨痗aspase-3抗體（cleaved caspase-3，該抗體只和活化caspase-3結(jié)合，不和非活化全長(zhǎng)caspase-3結(jié)合，產(chǎn)品號(hào)：#9664），HSP27抗體（產(chǎn)品號(hào)：#2402）及βactin抗體（產(chǎn)品號(hào)：#4967）購(gòu)于美國(guó)cell signaling公司。細(xì)胞蛋白裂解液購(gòu)于碧云天公司。PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。HSP27 siRNA合成于廣州銳博生物有限公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司。

1.3 MTT試驗(yàn) 將T98G細(xì)胞按2000個(gè)/孔接種于96孔板，加入200μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并分別予5、25、50、100和200μM的槲皮素培養(yǎng)24、48h，對(duì)照組為不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24、48h。加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式：抑制率＝（OD對(duì)照組-OD槲皮素組）/OD對(duì)照組× 100%。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) T98G細(xì)胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測(cè)。在T98G細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入25、50、100μM的槲皮素培養(yǎng)24h，對(duì)照組不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24h，之后按照試劑說(shuō)明書(shū)將PI和Annexin V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Annexin V單陽(yáng)性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞為晚期凋亡[6]，因此細(xì)胞凋亡率用Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示。

1.5 Western blot試驗(yàn) 在T98G細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入25、50和100μM的槲皮素培養(yǎng)24h，對(duì)照組為不加槲皮素同樣條件培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并裂解，裂解液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在HSP27一抗或cleaved caspase-3一抗稀釋液中孵育過(guò)夜，之后在帶辣根過(guò)氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，于暗室中曝光X線膠片，以HSP27或cleaved caspase-3蛋白條帶與β-actin蛋白條的灰度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將T98G細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)到鋪滿板面約80%時(shí)按Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)在 T98G細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 100nM的HSP27 siRNA或無(wú)關(guān)對(duì)照siRNA培養(yǎng)16h，之后加100μM的槲皮素再培養(yǎng)24h，檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，凋亡水平和 cleaved caspase-3表達(dá)水平。HSP27 siRNA序列為：正向：5'-GAGUGGUCGCAGUGGUUAGUU-3'；反向：5'-CUAACCACUGCGACCACUCUU-3'。無(wú)關(guān)RNA序列為正向：5'-UGGGAGCAGUCG UAGUGGUUU-3'；反向：5'-CUCCCAACCACUGCGA CUAUU-3'

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G的抑制作用

與對(duì)照組比較，T98G細(xì)胞在較小濃度槲皮素作用下即呈現(xiàn)出抗腫瘤效應(yīng)（濃度≥25μM），隨著槲皮素劑量增加，抗腫瘤生長(zhǎng)效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，用槲皮素治療48h較24h抑制作用更加明顯，提示槲皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用隨著治療時(shí)間的增加而增強(qiáng)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 不同濃度槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同濃度槲皮素處理24h比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組5μM槲皮素組25μM槲皮素組50μM槲皮素組100μM槲皮素組200μM槲皮素組孔數(shù) 槲皮素濃度（μM）3 3 3 3 3 3 0 5 2 5 50 100 200 24h抑制率（%）0 -0.04±0.03 14.5±2.1* 24.6±3.9* 45.3±5.6* 62.5±7.7* 48h抑制率（%）0 0.05±0.02 21.8±3.4*△42.2±5.7*△67.6±6.8*△76.9±7.0*△

表2 槲皮素下調(diào)HSP27表達(dá)并誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡（±s）

表2 槲皮素下調(diào)HSP27表達(dá)并誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組25μM槲皮素組50μM槲皮素組100μM槲皮素組孔數(shù)3 3 3 3槲皮素濃度（μM）0 25 50 100凋亡率（%）0.8±0.3 4.9±0.6* 8.1±0.9* 21.5±1.7* cleaved caspase-3 /β-actin 0.01±0.01 0.05±0.03 0.12±0.03* 0.22±0.05* HSP27 /β-actin 0.84±0.12 0.75±0.11 0.52±0.08* 0.37±0.06*

表3 HSP27 siRNA對(duì)槲皮素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表3 HSP27 siRNA對(duì)槲皮素發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與無(wú)關(guān)siRNA組比較，#P＜0.05

組別對(duì)照組無(wú)關(guān)siRNA組HSP27 siRNA組孔數(shù)HSP27 siRNA（nM）3 3 3 0 0 100無(wú)關(guān)siRNA（nM）100 100 0槲皮素濃度（μM）0 100 100 HSP27/β-actin 0.79±0.13 0.40±0.07* 0.15±0.04*#24h抑制率（%）0 42.5±5.7* 68.9±6.8*#凋亡率（%）0.9±0.3 22.4±1.9* 36.8±2.5*#cleaved caspase-3/β-actin 0.01±0.01 0.19±0.04* 0.31±0.07*#

2.2 槲皮素下調(diào)T98G細(xì)胞HSP27的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 T98G細(xì)胞用槲皮素治療后用Annexin V/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)槲皮素呈劑量依賴性誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡，見(jiàn)表2。Caspase-3是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵蛋白，當(dāng)caspase-3被激活后，通過(guò)切斷多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[7]。Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素治療使T98G細(xì)胞cleaved caspase-3水平顯著提高。HSP27的表達(dá)水平顯著降低，見(jiàn)表2。提示槲皮素可能通過(guò)下調(diào)HSP27的表達(dá)，誘導(dǎo)T98G細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3 HSP27基因沉默增強(qiáng)槲皮素的抗腫瘤活性 利用基因沉默技術(shù)，將HSP27 siRNA或無(wú)關(guān)siRNA通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到T98G細(xì)胞中，之后將100μM槲皮素加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，檢測(cè)HSP27基因沉默后槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HSP27 siRNA可顯著降低HSP27的表達(dá)，增強(qiáng)槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA組比較，轉(zhuǎn)染HSP27 siRNA槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力顯著增強(qiáng)，cleaved caspase-3表達(dá)水平大大提高，見(jiàn)表3。提示HSP27蛋白是神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抵抗凋亡的關(guān)鍵分子，槲皮素可能通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞HSP27的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的特征之一是高表達(dá)熱休克蛋白，這可能是因?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞處于高度低氧和pH失衡狀態(tài)，熱休克蛋白的細(xì)胞保護(hù)作用是腫瘤存活不可缺少的重要機(jī)制[8]。在熱休克蛋白家族中，HSP27通過(guò)與凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，阻斷凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)并抑制caspase的活化，從而對(duì)保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃避凋亡起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[9]。此外，HSP27還能抑制前caspase-9和前caspase-3的表達(dá)，并抑制從線粒體中釋放的細(xì)胞色素C的活性來(lái)達(dá)到阻斷凋亡的目的[10]。槲皮素是一種天然黃酮素，具有良好的抗腫瘤活性能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制包括打開(kāi)腫瘤細(xì)胞線粒體膜孔道釋放細(xì)胞色素C，活化caspase-9和caspase-3等途徑[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素具有顯著的體外抗神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生物效應(yīng)，誘導(dǎo)腦癌細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可顯著下調(diào)熱休克蛋白27這一關(guān)鍵的抗凋亡蛋白，這可能是槲皮素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。當(dāng)用HSP27 siRNA轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞使HSP27基因沉默后，槲皮素對(duì)T98G細(xì)胞的凋亡效應(yīng)和caspase-3的活化程度都顯著增強(qiáng)，這些結(jié)果都支持了槲皮素誘導(dǎo)T98G細(xì)胞凋亡依賴于HSP27的下調(diào)這一觀點(diǎn)。綜上所述，本研究結(jié)果顯示槲皮素有潛在的抗腦腫瘤的生物效應(yīng)，為腦腫瘤的藥物治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

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（收稿：2014-10-23 修回：2014-12-26）

Effect of Quercetin on Apoptosis in Glioblastoma Cell Line T98G and the Expression of HSP27 Protein

TAO Xiaowei1,MAO Qifeng2. 1Gongshu District Xiaohe Hushu Street Community Health Center,Hangzhou (310011),China;2Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect and mechanism of natural medicine quercetin on glioblastoma cells.M ethods T98G cells were treated with quercetin and the proliferation was measured by using the MTT assay.The apoptosis of T98G was measured by flow cytometry and the expression of cleaved caspase-3 and HSP27 in T98G cells treated with quercetin was detected by western blot.The specific siRNA transfected method was used for blocking the expression of HSP27 gene before T98G cells were treated with quercetin,then the proliferation and apoptosis were detected.Results The 48-hour proliferation inhibition rates of T98G cells in control group,5μM quercetin group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,100μM quercetin group,and 200μM quercetin group were 0,（0.05±0.02）%,（21.8±3.4）%,（42.2±5.7）%,（67.6±6.8）%,（76.9±7.0）%,respectively,with significant difference among them（P＜0.05）.The apoptosis rate of T98G cells in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were（0.8±0.3）%,（4.9±0.6）%,（8.1±0.9）%,（21.5±1.7）%, respectively,with significant difference among them（P＜0.05）;caspase-3 activity ratio in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were 0.01±0.01,0.05±0.03,0.12±0.03,and 0.22±0.05,with significant difference between control group and 50μM quercetin group and 100μM quercetin group（P＜0.05）;HSP27 inhibition ratio in control group,25μM quercetin group,50μM quercetin group,and 100μM quercetin group were 0.84±0.12,0.75±0.11,0.52±0.08,and 0.37±0.06,with significant difference between control group and 50μM quercetin group and 100μM quercetin group（P＜0.05）.Conclusion Quercetin has some anti-glioblastoma effect,and the underlying mechanism may be through down-regulating the expression of HSP27.

glioblastoma;quercetin;T98G;HSP27;apoptosis;caspase-3

1杭州市拱墅區(qū)小河湖墅街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科（杭州 310011）；2浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310012）

陶曉薇，Tel：13777406008；E-mail：qongshutaoxiaowei@163.com