陳琦光等

摘 要 希金斯刺盤(pán)孢（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是一種世界性分布的重要植物病原真菌，可引起嚴(yán)重的十字花科植物炭疽病，影響作物品質(zhì)并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。效應(yīng)分子在植物病原真菌侵染寄主植物過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)已公布的希金斯刺盤(pán)孢的全基因組信息，以其全基因組蛋白序列為材料，通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)其候選效應(yīng)分子及其功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。首先利用SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor 和TargetP程序依次預(yù)測(cè)出其分泌類(lèi)型的蛋白，再通過(guò)其序列大小和半胱氨酸含量作進(jìn)一步篩選，最后利用blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有蛋白同源性的序列，從而獲得候選效應(yīng)分子；同時(shí)對(duì)希金斯刺盤(pán)孢全基因組的16 150個(gè)蛋白序列進(jìn)行分析，最終預(yù)測(cè)到135個(gè)符合條件的候選效應(yīng)分子，而大多數(shù)都是功能未知的假定蛋白。本研究采用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測(cè)出了希金斯刺盤(pán)孢的候選效應(yīng)分子，為進(jìn)一步研究這些效應(yīng)分子的功能奠定了基礎(chǔ)，其研究技術(shù)和手段也為其它真菌效應(yīng)分子的預(yù)測(cè)提供了重要的參考資料。

關(guān)鍵詞 希金斯刺盤(pán)孢；效應(yīng)分子；信號(hào)肽；十字花科植物炭疽?。簧镄畔W(xué)

中圖分類(lèi)號(hào) S436.34 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Colletotrichum higginsianum Sacc. is one of the important phytopathogenic fungi worldwide， and often causes severe anthracnose disease on a wide range of cruciferous plants， which influences the quality of infected crops and causes serious economic losses. The effectors of phytopathogenic fungi play an important role during the infection process of fungal pathogens on their host plants. In this study， the candidate effectors and their functions were predicted and analyzed by using bioinformatic methods based on the published full-length genome sequence of C. higginsianum and on the derived protein sequences of C. higginsianum. Firstly，all secreted proteins were predicted with SignalP， TMHMM， Protcomp， big-PI Predictor and TargetP programs. And then， a further screening through the sequence size and the cysteine content of predicted proteins was carried out. Finally， the candidate effectors were aligned with the non-redundant protein database using blastp tools， and those sequences without protein homology in the database were identified so as to obtain the candidate effectors. As a result， 135 candidate effectors of C. higginsianum were predicted by analyzing 16 150 protein sequences of C. higginsianum， and most of them are the hypothetical proteins with unknown function. Taken together， the candidate effectors of C. higginsianum were predicted by using bioinformatic methods， which lay a foundation for the further study of the functions of these effectors， and the results can also provide reference for the prediction of other fungal effectors.

Key words Colletotrichum higginsianum； Effectors； Signal peptide； Crucifer anthracnose； Bioinformatics

刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum），俗稱(chēng)炭疽菌屬，是一類(lèi)世界性分布的、十分重要的植物病原真菌，其寄主范圍非常廣泛，能引起農(nóng)作物、果樹(shù)、蔬菜和林木等眾多的植物炭疽病，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，在熱帶、亞熱帶地區(qū)尤為嚴(yán)重[1-2]。其中的希金斯刺盤(pán)孢（C. higginsianum Sacc.），俗稱(chēng)十字花科炭疽菌，可引起嚴(yán)重的十字花科植物炭疽病[3]。

植物在與病原菌相互作用過(guò)程中，病原菌分泌效應(yīng)分子到寄主植物細(xì)胞中，對(duì)寄主植物細(xì)胞的生理、生化過(guò)程及細(xì)胞代謝等產(chǎn)生顯著的影響，并克服寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)，從而促進(jìn)和完成對(duì)寄主植物的侵染[4]。效應(yīng)分子一般具有以下特征[5-7]：（1）含有N-端信號(hào)肽；（2）無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；（3）無(wú)糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn)；（4）沒(méi)有將蛋白輸送至線(xiàn)粒體或其它胞內(nèi)細(xì)胞器的預(yù)測(cè)定位信號(hào)；（5）氨基酸殘基數(shù)量大約在50～300氨基酸；（6）富含半胱氨酸而且特異性高。關(guān)于病原菌效應(yīng)分子的研究，目前已通過(guò)圖位克隆分離克隆得到許多植物病原效應(yīng)蛋白基因，并結(jié)合異源表達(dá)分析及結(jié)構(gòu)生物物理手段對(duì)部分效應(yīng)蛋白基因表達(dá)產(chǎn)物的功能進(jìn)行了鑒定[8-10]。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外從細(xì)胞和分子水平上研究希金斯刺盤(pán)孢對(duì)十字花科植物致病機(jī)制的有關(guān)研究報(bào)道較少。其中多數(shù)研究是以擬南芥作為寄主植物進(jìn)行研究的，因?yàn)槠淙蚪M序列已經(jīng)公布，并獲得了大量的人工突變體，而希金斯刺盤(pán)孢（C. higginsianum）具有特別的營(yíng)養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，且可進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[11-12]。此外，構(gòu)建由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的希金斯刺盤(pán)孢T-DNA插入突變體庫(kù)，通過(guò)將突變體的分生孢子接種到離體和活體的擬南芥葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而揭示了希金斯刺盤(pán)孢與擬南芥互作的分子機(jī)制[13-14]。希金斯刺盤(pán)孢-擬南芥的互作系統(tǒng)已成為病原菌與寄主植物分子互作研究的一個(gè)典型模式[15]。最近對(duì)希金斯刺盤(pán)孢的序列和轉(zhuǎn)錄組分析顯示，該病原菌的大多數(shù)候選效應(yīng)分子具有種的特異性，而且通過(guò)對(duì)其侵染過(guò)程中的效應(yīng)分子分析表明，大多數(shù)的效應(yīng)分子是在其活體寄生的階段被誘導(dǎo)的[16-17]。因此，以十字花科蔬菜-菜心（Brassica parachinensis Bailey）[18-19]作為希金斯刺盤(pán)孢的寄主植物材料，將更有利于分析該病原菌與十字花科蔬菜之間互作的本質(zhì)及其致病的分子機(jī)制。本研究根據(jù)已公布的希金斯刺盤(pán)孢全基因組信息，通過(guò)生物信息學(xué)方法，對(duì)其中的候選效應(yīng)分子及其功能進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)和分析，以期為下一步的希金斯刺盤(pán)孢效應(yīng)分子的篩選及其功能研究并為闡明這些效應(yīng)分子在致病過(guò)程中的作用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

來(lái)自希金斯刺盤(pán)孢（C. higginsianum）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.broad-institute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiDownloads.html）中的該病菌全基因組的16 150條蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 SignalP 4.1 Server SignalP 4.1 Server[20]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）是信號(hào)肽預(yù)測(cè)的服務(wù)器，它的功能是預(yù)測(cè)給定的氨基酸序列中是否存在潛在的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)及其所在位置，原核生物和真核生物都可以進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前服務(wù)器提供的是SignalP 4.1版本。以SignalP 4.1分析獲得預(yù)測(cè)蛋白的 C、S 和 Y的最大值，以及位于N 端和被預(yù)測(cè)的剪切位點(diǎn)間的 S曲線(xiàn)的中間值，以此區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽。而信號(hào)肽剪切位點(diǎn)則位于預(yù)測(cè)的含有信號(hào)肽蛋白的Y曲線(xiàn)的最大值處。本實(shí)驗(yàn)中使用默認(rèn)設(shè)置。

1.2.2 TMHMM Server v. 2.0 TMHMM Server v. 2.0[21]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）主要用于預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 ProtComp v. 9.0 ProtComp v. 9.0[22]（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcompa-n&group=programs& subgroup=proloc）主要是對(duì)動(dòng)物或真菌中的蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，它可將蛋白按以下歸屬進(jìn)行劃分：細(xì)胞核、質(zhì)膜、胞外分泌、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧物酶體、溶酶體和高爾基體。

1.2.4 Big-PI Predictor Big-PI Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）對(duì)在真菌GPI（糖基磷脂酰肌醇）修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，判斷預(yù)測(cè)蛋白是否有脂質(zhì)錨定修飾。如果存在糖基磷脂酰肌醇脂質(zhì)錨定修飾，真核生物中蛋白質(zhì)需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

1.2.5 TargetP 1.1 Server TargetP 1.1 Server[23]（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）用于進(jìn)一步確定預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位，可將蛋白的定位歸屬于線(xiàn)粒體、葉綠體、胞外分泌以及其它亞細(xì)胞定位。位置分配是基于任何的N-末端的前序列預(yù)測(cè)存在：葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（CTP），線(xiàn)粒體靶向肽（MTP）或分泌途徑的信號(hào)肽（SP）。

1.2.6 CalMolWt CalMolWt（http：//www.cnhupo.cn/CalMW/MYMW.asp）蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成的計(jì)算器。用于分析篩選出的序列的半胱氨酸含量。

1.2.7 LipoP 1.0 Server LipoP 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP）用來(lái)預(yù)測(cè)脂蛋白，也用來(lái)區(qū)分脂蛋白信號(hào)肽、其他信號(hào)肽和格蘭氏陰性菌N端膜螺旋。

1.2.8 BLASTP BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch &LINK_LOC=blasthome）是使用蛋白序列到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)的一種工具。每條所查序列能與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的每條已知序列進(jìn)行序列比對(duì)，可以通過(guò)所得結(jié)果結(jié)合參數(shù)得到與此相關(guān)的信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯刺盤(pán)孢效應(yīng)分子全基因組預(yù)測(cè)

在希金斯刺盤(pán)孢（C. higginsianum）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載全基因組序列，其中含有16 150條氨基酸序列，其基因組分析見(jiàn)表1。

SignalP v4.1 是用于預(yù)測(cè)原核及真核生物氨基酸序列中信號(hào)肽切割位點(diǎn)是否存在及其存在的具體位置，該軟件綜合了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial Neural Networks）算法和隱馬可夫模型（Hidden Markov Models）的功能[24]。根據(jù)上述的效應(yīng)分子的6個(gè)特征，使用SignalP 4.1 Server對(duì)16 150個(gè)蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)得到有1 528個(gè)編碼含N端信號(hào)肽的蛋白，占全基因組蛋白序列的9.46%；對(duì)所得的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度小于450 aa的序列最多，占了全部的77.20%（圖1）。

在含有信號(hào)肽的分泌型蛋白質(zhì)序列中，如果含有跨膜區(qū)則表明該蛋白可能為膜受體，也可能是膜上的錨定蛋白或者離子通道蛋白。本研究使用TMHMM Server v. 2.0來(lái)預(yù)測(cè)蛋白序列的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，排除具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。從蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果可以看到，在含信號(hào)肽的1 528個(gè)蛋白中，有89個(gè)蛋白序列含有兩個(gè)或多個(gè)跨膜域，174個(gè)蛋白序列只含有1個(gè)跨膜域，而有1 265個(gè)蛋白序列則不含跨膜域。只含1個(gè)跨膜域的蛋白質(zhì)，其所具有的跨膜結(jié)構(gòu)域位置均位于N端，該區(qū)域可能為前期所預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，而且服務(wù)器并不能完全對(duì)信號(hào)肽序列和所屬跨膜域區(qū)序列進(jìn)行區(qū)分。因此，本研究選擇不含跨膜域和只含有1個(gè)跨膜域的1 439個(gè)蛋白序列進(jìn)行下一步研究。

將上述初步篩選出的1 439個(gè)蛋白序列進(jìn)一步用ProtComp v. 9.0進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)到共有782個(gè)信號(hào)肽分泌至胞外，17個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，177個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜，88個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，207個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體，55個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，19個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至過(guò)氧化物酶體，69個(gè)傳輸至溶酶體，20個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，5個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡（圖2）。繼而進(jìn)行GPI錨定蛋白的預(yù)測(cè)，以判斷這些被初步推斷為分泌蛋白是否為胞外蛋白。將782個(gè)分泌蛋白用big-PI Predictor 程序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有46個(gè)為GPI錨定蛋白，而736個(gè)為非GPI錨定蛋白。由于在真核細(xì)胞中，分泌蛋白的分泌目標(biāo)有可能是胞內(nèi)細(xì)胞器，而非胞外。因而需要進(jìn)一步用 TargetP v1.1以排除非胞外分泌蛋白。對(duì)736個(gè)非GPI錨定的分泌蛋白的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有11個(gè)含有線(xiàn)粒體定位信號(hào)，2個(gè)含有其它定位信號(hào)，剩下723個(gè)蛋白序列都含有胞外定位信號(hào)。

由于效應(yīng)分子的氨基酸殘基數(shù)量一般在50～300 aa之間[25-26]，因此將這723個(gè)序列按照其長(zhǎng)度進(jìn)行排列，明確了其中有457個(gè)蛋白的氨基酸殘基數(shù)量在50～300 aa之間。此外，根據(jù)效應(yīng)分子富含半胱氨酸的特點(diǎn)，利用CalMolWt 計(jì)算所有候選序列的半胱氨酸含量。將不含半胱氨酸的序列排除之后，得到418個(gè)半胱氨酸殘基含量在1～27數(shù)量不等的蛋白序列。最后，將上述符合條件的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用blastp工具與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出那些與數(shù)據(jù)庫(kù)中的沒(méi)有同源性的序列，要求其E-value值小于1e-5。最終得到135個(gè)符合上述所有6個(gè)條件的候選效應(yīng)分子，其中有30個(gè)蛋白序列在數(shù)據(jù)庫(kù)了沒(méi)有任何與之同源的序列，剩余的105個(gè)除了與刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）的序列有同源性外，與其他物種都沒(méi)有同源性。

2.2 希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子信號(hào)肽特征分析

現(xiàn)已明確大多數(shù)物種的信號(hào)肽主要是通過(guò) 4 種類(lèi)型的信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)被信號(hào)肽酶所識(shí)別并被切割，從而使成熟蛋白穿過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞不同的部位[27]。本研究通過(guò)對(duì)135個(gè)候選效應(yīng)分子所含的信號(hào)肽氨基酸長(zhǎng)度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，含有信號(hào)肽長(zhǎng)度為17～22 aa的蛋白質(zhì)序列數(shù)量最多，所占比例為82.22%，其中尤以所含信號(hào)肽長(zhǎng)度為19 aa的蛋白序列居多，所占比例為18.52%（圖3）。

利用LipoP 1.0 Server對(duì)上述分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示119個(gè)蛋白序列含有SpI型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，14個(gè)含有CYT型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)以及2個(gè)含有SpII型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，所占比例分別為88.15%、10.37%和1.48%，說(shuō)明希金斯刺盤(pán)孢中的候選效應(yīng)分子大部分是由SpI型信號(hào)肽酶進(jìn)行識(shí)別。

此外還對(duì)20種氨基酸在135個(gè)候選效應(yīng)分子信號(hào)肽中出現(xiàn)的頻率進(jìn)行了分析（圖4），結(jié)果表明，在組成信號(hào)肽的氨基酸中，丙氨酸（A）的數(shù)量為579，數(shù)量最多，占21.64%；其次為亮氨酸（L），486個(gè)，占全部的18.16%；其他的依次為絲氨酸（S）、 纈氨酸（V）、 苯丙氨酸（F）、 蘇氨酸（T）、 蛋氨酸（M）、 異亮氨酸（I）、 甘氨酸（G）、 脯氨酸（P）、 精氨酸（R）、 谷氨酰胺（Q）、 賴(lài)氨酸（K）、 酪氨酸（Y）、 半胱氨酸（C）、 組氨酸（H）、 天冬酰胺（N）、 谷氨酸（E）、 色氨酸（W）和天冬氨酸（D），分別占9.34%、8.30%、7.14%、6.99%、5.49%、5.23%、2.99%、2.80%、2.50%、2.32%、1.94%、1.08%、1.05%、0.90%、0.82%、0.64%、0.45%和0.22%。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，非極性、疏水的氨基酸出現(xiàn)頻率最高（A、V、L、G、I和P），占59.12%；其次為有極性、不帶電荷的氨基酸（S、T、C、M、N和Q），占26.01%；帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（A和E）占22.27%；帶正電荷的堿性氨基酸（K、R和H）占5.34%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占8.67%。

使用MEME[28]對(duì)希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子信號(hào)肽序列進(jìn)行基序（motif）分析，發(fā)現(xiàn)存在一種氨基酸組成模式為M[KR]FSTL[LA]L[AL][LA]的基序（圖5）；對(duì)所有分泌蛋白進(jìn)行基序分析發(fā)現(xiàn)，除了位于信號(hào)肽中的基序外，還存在另外2種基序，分別為P[GQ][LR][KR]E [SY][FR][CR]R和[HP][CQ][LS][RS] W [DG][LW]。

2.3 希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子的功能分析

對(duì)預(yù)測(cè)獲得的135個(gè)希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子與GenBank的非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Nr和SWISS-PROT的uniprot_sprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以獲得蛋白的參考功能信息。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，11個(gè)效應(yīng)分子具有預(yù)測(cè)功能（表2），其余124個(gè)效應(yīng)分子皆為功能未知的假定蛋白。從表2中可以看出，大部分候選效應(yīng)分子都為有預(yù)測(cè)功能的假定蛋白，但這些所列出的功能對(duì)于維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)都具有重要作用。然而，這些功能描述的僅僅是預(yù)測(cè)的結(jié)果，它們的真實(shí)性還有待通過(guò)有關(guān)實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，大多數(shù)預(yù)測(cè)出的希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子均為功能未知的假定蛋白，也正是由于其具有特異性而形成的（正如效應(yīng)蛋白的其中一個(gè)特征所示：富含半胱氨酸而且特異性高）。

3 討論與結(jié)論

希金斯刺盤(pán)孢全基因組測(cè)序的完成和公布，為希金斯刺盤(pán)孢的分泌蛋白、致病因子和與植物之間互作的研究提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究預(yù)測(cè)得到135個(gè)符合要求的希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子，大多屬于小型蛋白，其信號(hào)肽集中在17～22 aa且含有SpI型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)于希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子功能的初步分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)出的92%候選效應(yīng)分子為功能未知的假定蛋白。而且，其中大概有30%的希金斯刺盤(pán)孢的蛋白與禾生刺盤(pán)孢（C. graminicola，俗稱(chēng)禾谷炭疽病菌）的蛋白同源。一方面，說(shuō)明了候選蛋白具有特異性，其未知功能需要進(jìn)一步驗(yàn)證分析；另一方面，也可以為研究禾生刺盤(pán)孢的效應(yīng)分子以及其它刺盤(pán)孢的效應(yīng)分子的共性提供一個(gè)思路。此外，目前已發(fā)現(xiàn)在卵菌和真菌中含有RxLx、LxAR（x，代表任何氨基酸）等保守基序[25，29]。本研究試圖通過(guò)對(duì)希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子的基序進(jìn)行研究，但無(wú)法找到上述類(lèi)似的基序。雖然目前已有不少物種開(kāi)展了效應(yīng)分子的研究，但都沒(méi)發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的基序。在刺盤(pán)孢屬真菌里是否存在像卵菌一樣有規(guī)律的保守基序，還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究才能夠得出相應(yīng)的結(jié)論。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段，對(duì)希金斯刺盤(pán)孢候選效應(yīng)分子進(jìn)行了預(yù)測(cè)。與此同時(shí)，本研究也參考了前人利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）[30]、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）[31]、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）[32]、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）[33]和米曲霉（Aspergillus oryzae）[34]等進(jìn)行了蛋白類(lèi)型的預(yù)測(cè)，根據(jù)真菌效應(yīng)分子的特點(diǎn)，選擇合適合理的預(yù)測(cè)服務(wù)器和相關(guān)軟件進(jìn)行分析，保證了預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，但同時(shí)也可能在一定程度上漏掉一部分效應(yīng)分子，特別是那些不符合效應(yīng)分子特征但具有效應(yīng)分子功能的蛋白[17，35]。因此，需要對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究已將部分候選效應(yīng)分子克隆出來(lái)，并進(jìn)行了功能篩選，證明了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性（另文發(fā)表），為進(jìn)一步研究希金斯刺盤(pán)孢效應(yīng)分子的功能打下了基礎(chǔ)。

Kleemann等[17]對(duì)希金斯刺盤(pán)孢進(jìn)行了基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，得到了較多具有酶和效應(yīng)分子等功能的蛋白質(zhì)，其中從不同細(xì)胞類(lèi)型和侵染階段相關(guān)的真菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序生成的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）中得到327個(gè)候選效應(yīng)分子，但其中含有部分不含信號(hào)肽、不含半胱氨酸和沒(méi)有特異性的蛋白。而O'Connell等[16]在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中，將希金斯刺盤(pán)孢測(cè)序得到的序列通過(guò)與刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum）之外的沒(méi)有同源性的序列進(jìn)行BLAST，從而得到365個(gè)候選效應(yīng)分子，其中72%的候選效應(yīng)分子是物種特異性的，與禾生刺盤(pán)孢（C. graminicola）的效應(yīng)分子缺乏同源性。而本研究沒(méi)有直接從ESTs或直接利用BLAST進(jìn)行預(yù)測(cè)，而是試圖先得到分泌蛋白，再進(jìn)行同源比對(duì)而得到候選效應(yīng)分子。根據(jù)真菌效應(yīng)分子的特征，通過(guò)一個(gè)規(guī)范的流程得到的候選效應(yīng)分子，更有利于對(duì)其進(jìn)行共性的分析，也為其他真菌效應(yīng)分子的預(yù)測(cè)提供參考。

隨著更多的植物病原真菌全基因組序列的公布，將為進(jìn)一步利用生物信息學(xué)手段和方法對(duì)這些病原真菌的效應(yīng)分子進(jìn)行分析提供了條件。如禾生刺盤(pán)孢（C. graminicola）已最終預(yù)測(cè)明確286個(gè)具有典型特征的效應(yīng)分子[36]，而楊生褐盤(pán)二孢菌（Marsonina brunnea）最終預(yù)測(cè)得到106個(gè)候選效應(yīng)因子[26]，稻瘟病菌（M. oryzae）通過(guò)候選基因進(jìn)行表達(dá)分析和同源比對(duì)最終發(fā)現(xiàn)有42個(gè)符合條件的分泌蛋白基因[37]等。同時(shí)，基因組測(cè)序加快了功能基因的研究速度，可以根據(jù)某個(gè)基因的序列來(lái)推測(cè)其相應(yīng)功能進(jìn)而進(jìn)行功能驗(yàn)證，這樣就可以批量地研究生物基因的功能。當(dāng)獲得了預(yù)測(cè)得到的候選效應(yīng)分子后，需通過(guò)原核表達(dá)及PCD（programmed cell death，細(xì)胞程序性死亡）檢測(cè)才可以驗(yàn)證候選效應(yīng)分子是否為效應(yīng)分子，從而更好地研究其功能及其與寄主植物之間的相互作用。

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