令狐昌敏 程玲玲 譚翔勻

【摘 ? 要】 目的 ?建立HPLC法測(cè)定益精散中2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。方法 ?色譜柱為Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5ul），以乙腈-水（20：80）為流動(dòng)相;流速為：1.0ml？min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。結(jié)果 ?2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷線性范圍為0.20μg-0.46μg（r=0.9999）;平均回收率為98.7%，RSD為0.89%。結(jié)論 ?本法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。

【關(guān)鍵詞】 HPLC;益精散;2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】 R284 ? ?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

益精散由何首烏、南五味子、枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、熟地黃、淫羊藿、鎖陽(yáng)、巴戟天、山茱萸、肉蓯蓉等十二味中藥組成，具有溫腎壯陽(yáng)、滋陰補(bǔ)腎、疏肝通氣、活血通精的功效。用于無(wú)精子癥、少精子癥、死精子癥、畸形精子癥等。原標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)主要藥材的含量測(cè)定方法，本試驗(yàn)參照《中國(guó)藥典》2010版一部何首烏含量測(cè)定項(xiàng)[1]，用高效液相法測(cè)定2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量，作為控制本品的質(zhì)量依據(jù)，結(jié)果該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠。

1 ?儀器與試藥

1.1 ?儀器 ?島津LC-20AD型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，KQ-300DE超聲儀，AB204-S型萬(wàn)分之一和AB265-S型十萬(wàn)分之一梅特勒-托利多電子天平。

1.2 ?試藥 ?2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院 批號(hào)：110844-201310，純度91.0%）;益精散（5g/袋，貴州百花醫(yī)藥股份有限公司受托配制）乙腈為色譜純，水為純凈水，其他均為分析純。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 ?色譜條件 ?色譜柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm ，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（20：80）;流速為：1.0ml？min-1;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為320nm。進(jìn)樣量20μl，理論塔板數(shù)按2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計(jì)不低于3000。

2.2 ?系統(tǒng)適應(yīng)性考察

2.2.1 ?對(duì)照品溶液制備 ?十萬(wàn)分之一電子天平精密稱取2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：110844-201310，純度91.0%）9.75mg，置50ml棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備溶液。再精密量取對(duì)照品貯備溶液3ml置25ml容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.0213mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 ?供試品溶液制備 ?取供試品內(nèi)容物，混勻，精密稱取0.2g，置25ml棕色容量瓶中，加稀乙醇20ml，超聲30min，取出，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)慮制得供試品溶液。

2.2.3 ?陰性對(duì)照溶液的制備 ?參照貴州省食品藥品監(jiān)督管理局黔制劑字Z20030354益精散制備工藝制備缺制何首烏益精散，照“2.2.2”法制備缺制何首烏陰性對(duì)照溶液。照“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別精密吸取上述溶液各20ul進(jìn)樣，結(jié)果在2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品主峰相同的位置上，供試品溶液在主峰位置上出峰，陰性對(duì)照溶液無(wú)色譜峰出現(xiàn)，，陰性對(duì)照品色譜峰與陽(yáng)性對(duì)照品色譜峰疊加，與供試品色譜圖相似性良好。表明本法的專屬性良好，陰性不干擾本法的測(cè)定。見(jiàn)圖1-圖3。

圖1 ?2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷

HPLC對(duì)照?qǐng)D譜

圖2 ?益精散樣品HPLC圖譜

圖3 ?缸制何首烏的益精散樣品HPLC圖譜

2.3 ?線性關(guān)系的考察 ?精密吸取濃度（0.0213mg/ml）對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、15、20、25、30、35ul，測(cè)定峰面積，以2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，計(jì)算2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷回歸方程為：Y= 3590243 x-25603 ?r=0.9997。結(jié)果表明2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.11μg-0.76μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 ?精密度試驗(yàn) ?精密吸取供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)測(cè)定5次，其峰面積的RSD=0.41%，結(jié)果表明精密度良好。

2.5 ?穩(wěn)定性試驗(yàn) ?精密吸取供試品溶液20μl，分別在0、2、4、8、12小時(shí)測(cè)定一次，其峰面的RSD為1.36%，表明供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?精密稱取本品粉末約0.2g，共5份，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。精密吸取溶液各20μl，測(cè)定2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面積積分值，平均含量為0.27%，RSD=1.11%，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.7 ?加樣回收試驗(yàn) ?取已知含量（2.72mg/g）的樣品6份，每份約為0.1g，精密稱定，分別精密加入已知濃度的2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷溶液（0.177 mg/ml，稀乙醇制）1、1.5、2 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.8”項(xiàng)下的方法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 ?含量測(cè)定 ?分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 ?討論

4.1 ?2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在強(qiáng)光、堿性條件下極不穩(wěn)定，故試驗(yàn)時(shí)要避光操作。

4.2 ?益精散原標(biāo)準(zhǔn)中，無(wú)主要藥材的含量測(cè)定方法，鑒于制何首烏在本方中所起的補(bǔ)肝腎，益精血，安神作用，本研究以2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量為指標(biāo)，結(jié)果在實(shí)驗(yàn)測(cè)定條件下其HPLC峰不受雜質(zhì)峰的干擾，測(cè)試結(jié)果比較準(zhǔn)確，可為益精散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

4.3 ?參照何首烏藥材的含量測(cè)定條件，試驗(yàn)了流動(dòng)相乙腈-水不同的比例（25：75）和（20：80），結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水（25：75）樣品不能達(dá)到基線分離，故確定流動(dòng)相乙腈-水為（20：80）。

4.4 ?樣品提取方法，試驗(yàn)了加熱回流1h與超聲處理30min[2]，結(jié)果含量無(wú)顯著差異，故確定超聲提取時(shí)間為30min。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)主編.中華人民共和國(guó)藥典[M].第1部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：717.

[2] 陸蘊(yùn)如，鄧巧虹，等.何首烏及其制劑中2，3，5，4`-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量測(cè)定研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 1998，21（6）：31-33.