張正鋒，張 毅

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)所·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121)

中藥材及其制劑在加工、運(yùn)輸、儲存過程中經(jīng)常會發(fā)生霉變現(xiàn)象，產(chǎn)生霉菌毒素，其中以黃曲霉毒素的毒性最大。黃曲霉毒素已被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究中心確定為一類致癌物，其毒性為氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。當(dāng)前世界各國已在很多食品、藥品標(biāo)準(zhǔn)中都制訂了嚴(yán)格的黃曲霉毒素殘留限度，2010年版《中國藥典(一部)》已開始對中藥材中黃曲霉毒素進(jìn)行控制，并收載了黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1的檢測方法。愈傷靈膠囊為傳統(tǒng)中成藥，處方包括土鱉蟲、續(xù)斷、三七、當(dāng)歸、自然銅等藥味，其中土鱉蟲可能污染黃曲霉毒素[1]，且土鱉蟲、當(dāng)歸、三七都是原生藥粉入藥，因此有必要制訂黃曲霉毒素檢查項(xiàng)，以控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證用藥安全?！吨袊幍?一部)》只對桃仁、胖大海、陳皮、僵蠶等中藥材規(guī)定了限度，香港衛(wèi)生署公布的中藥材標(biāo)準(zhǔn)中對當(dāng)歸、三七制訂了黃曲霉毒素的限量檢查[2]。近年來越來越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，中成藥中也有黃曲霉毒素殘留[3－5]。本研究中按照2010年版《中國藥典(第二增補(bǔ)本)》附錄中黃曲霉毒素殘留量測定法[6]，采用免疫親和柱凈化－高效液相色譜(HPLC)－柱后光化學(xué)衍生－熒光檢測技術(shù)，測定愈傷靈膠囊中黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1的殘留量，并對陽性樣品采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)法進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀(Waters2475熒光檢測器＜美國Waters公司＞，光化學(xué)衍生器＜美國VICAM公司，紫外光燈254 nm＞，Waters ACQUITY TM串連四級桿質(zhì)譜儀＜MassLynx工作站＞);免疫親和層析柱(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司);MSU224S－100－DU型電子天平(德國Sartorius公司);超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);Z2064型離心機(jī)(德國HERMLE公司);Milli－Q超純水處理系統(tǒng)。愈傷靈膠囊為售樣品;甲醇、乙腈均為色譜純，水為高純水;黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品(黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2質(zhì)量濃度分別為 1.04，0.35，1.18，0.59 μg/mL，中國食品藥品檢定研究院，批號為610001－201301)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 HPLC

色譜柱:DikmaDiamonsilC18柱(250mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫:40℃;流動(dòng)相:甲醇(A)－乙腈(B)－水(C)，梯度洗脫(0～17 min，A 25% →45% ，B 10% ，C 65% →45%;17～18 min，A 45% →65%，B 10%，C 45%→25%;18 ～23 min，A 65%，B 10%，C 25%;23～24 min，A 65% →25% ，B 10% ，C 25% →65%);流速:1.1 mL/min;進(jìn)樣量:30 μL。采用柱后光化學(xué)衍生法:光化學(xué)衍生器(254 nm);以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex=360 nm，發(fā)射波長λem=450 nm。色譜見圖1。

2.1.2 UPLC － MS/MS

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1mm，1.7 μm);柱溫:30 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:A為甲醇－乙腈(3∶2)，B為0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫(0～5 min，A 40% →70% ，B 60% →30%;5～6 min，A 70% ，B 30%;6 ～6.5 min，A 70% →40% ，B 30% →60%);ESI正離子 MRM 模式:離子源溫度120℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流速500 L/h;鞘氣流速50 L/h;定性離子對及相關(guān)參數(shù)見表1。

2.2 溶液制備

圖1 高效液相色譜圖

表1 UPLC－MS/MS法定性離子對、錐孔電壓及碰撞能量

精密量取黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備液(黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度為50 ng/mL)。精密量取貯備液1 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液(黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度為2 ng/mL)。取供試品粉末5 g，精密稱定，加氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液50 mL，振搖使溶散，超聲處理30 min，離心5 min(離心速度4 000 r/min)，精密量取上清液10 mL，置50 mL容量瓶中，加水約 25 mL，振搖，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，用 0.45 μm微孔濾膜濾過;精密量取20 mL，通過免疫親合層析柱，流速為3 mL/min，再用水10 mL洗滌，洗液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，以1.5 mL甲醇以重力作用自然洗脫，收集洗脫液至2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋刻度，搖勻，即得供試品溶液。取70%甲醇溶液50 mL，按供試品溶液制備方法下操作，即得空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取黃曲霉毒素混合對照品溶液，分別進(jìn)樣3，5，10，15，20，25，30 μL，以各色譜峰峰面積(Y)對黃曲霉毒素絕對量(X)進(jìn)行回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 黃曲霉毒素線性范圍

精密度試驗(yàn):將混合對照品溶液(黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度為2 ng/mL)連續(xù)進(jìn)樣 6 次，依法測定。結(jié)果黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1的 RSD 分別為 1.29% ，1.45% ，1.88% ，1.51%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取不含黃曲霉毒素的樣品粉末5 g，精密稱定，精密加入黃曲霉毒素混合對照品貯備液0.1 mL，依法制備供試品溶液，分別于 0，4，8，12 h進(jìn)樣，依法測定。結(jié)果黃曲霉毒素 G2，G1，B2，B1含量的 RSD 分別為 1.43% ，1.09% ，1.58% ，1.09%(n=4)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取不含黃曲霉毒素的樣品粉末5 g，共6份，精密稱定，精密加入黃曲霉毒素混合對照品貯備液0.1 mL，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果黃曲霉素G2，G1，B2，B1的 RSD分別為8.0% ，10.9% ，8.9%，6.2%(n=6)，表明該法重復(fù)性良好[2]。

加樣回收試驗(yàn):對該方法進(jìn)行三水平加樣回收試驗(yàn)。添加濃度以黃曲霉毒素B1計(jì)分別為1，5，10 μg/kg。取不含黃曲霉毒素的樣品粉末5 g，精密稱定，共取9份，分別精密加入混合對照品貯備液 0.1，0.5，1.0 mL，依法制備供試品溶液，測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。參照相關(guān)技術(shù)要求，回收率范圍應(yīng)為50% ～120%，RSD＜15%[2]，表明該法的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果符合要求。

表3 黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(%，n=9)

檢出限與定量限確定:將上述加樣回收試驗(yàn)的供試品溶液稀釋成適當(dāng)濃度進(jìn)樣分析，檢出限為信噪比(S/N)=3，定量限為S/N=10，則以黃曲霉毒素B1計(jì)，儀器檢出限為0.25 pg，定量限為 0.83 pg，本法的定量限為 0.14 μg/kg。黃曲霉毒素 B2，G1，G2按此方法得到的定量限分別為 0.06，0.21，0.13 μg/kg。

2.4 樣品含量測定

結(jié)合線性、加樣回收率及儀器檢出限與定量限測定，本試驗(yàn)報(bào)告限暫訂為:黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2及其總量(B1+B2+G1+G2)均為0.5 μg/kg，低于報(bào)告限的視為未檢出。測定了82批愈傷靈膠囊樣品，結(jié)果49批樣品檢出黃曲霉毒素，黃曲霉毒素總量≥10 μg/kg的有 9 批，其中 6 批黃曲霉毒素 B1≥5 μg/kg，見圖 2(僅列出陽性樣品黃曲霉毒素B1及總量)。

2.5 陽性樣品確證試驗(yàn)

圖2 陽性樣品含量測定結(jié)果

黃曲霉毒素B1，G1在含水的溶劑中發(fā)生熒光淬滅，經(jīng)波長254 nm的紫外光燈照射后，形成具有穩(wěn)定熒光的物質(zhì)，即是柱后光化學(xué)衍生的原理。故采用衍生與未衍生時(shí)黃曲霉毒素的峰面積比較，即可簡單地對陽性樣品進(jìn)行初步確認(rèn)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，衍生后黃曲霉毒素B1的峰面積約為未衍生時(shí)的9倍，G1的峰面積約為未衍生時(shí)的12倍，與郝愛魚等[7]報(bào)道基本一致。以每1成分選取2對靈敏度最高的子母離子，采用MRM模式檢測，樣品在與對照品相同保留時(shí)間處同時(shí)檢出2對離子對，且其強(qiáng)度的比值與對照品一致，即可確證樣品中含有黃曲霉毒素。MRM圖見圖3。

圖3 MRM離子流圖

3 討論

對供試品取樣量、提取方式、稀釋倍數(shù)等進(jìn)行了考察與優(yōu)化，每一個(gè)因素考察均以加樣回收率進(jìn)行評判，最終確定文中的試驗(yàn)方法。藥典HPLC方法采用了等度洗脫，洗脫時(shí)間長且分離度、峰形均欠佳。本研究改為梯度洗脫，4個(gè)成分的保留時(shí)間在12.0～17.5 min，峰形明顯改善且分離度均大于1.5。

對UPLC－MS/MS的流動(dòng)相、梯度洗脫程序、碰撞能量等進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，并對數(shù)批陽性樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，由于陽性樣品大多只檢出黃曲霉毒素B1，G1，僅少量檢出B2和G2且量極低，故本試驗(yàn)最終只對B1，G1進(jìn)行了確證。

樣品經(jīng)專屬性極強(qiáng)的免疫親和柱凈化后，在黃曲霉毒素色譜峰附近無干擾峰。鑒于中藥成分復(fù)雜，為了排除假陽性干擾，對陽性樣品采取了衍生/不衍生峰面積比及UPLC－MS/MS進(jìn)行確證。

由于黃曲霉毒素毒性極強(qiáng)而我國目前尚缺乏其毒理學(xué)等相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，因此建議參照2010年版《中國藥典(一部)》陳皮等藥材品種項(xiàng)下規(guī)定的黃曲霉毒素殘留量限度，暫訂愈傷靈膠囊中黃曲霉毒素限量為“本品每1 000 g含黃曲霉毒素B1不得過5 μg，含黃曲霉毒素 G2、黃曲霉毒素 G1、黃曲霉毒素 B2、黃曲霉毒素B1的總量不得過10 μg”。本次試驗(yàn)82批樣品黃曲霉毒素的檢出率為59.76%，不合格率為10.98%。

從愈傷靈膠囊中黃曲霉毒素的檢測情況看來，對于含有容易污染黃曲霉毒素的中藥材的中成藥，尤其是含生藥原粉的制劑，應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行黃曲霉毒素監(jiān)控。

[1]楊曉麗，仇 峰，韋日偉，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定地龍中4個(gè)黃曲霉毒素[J].藥物分析雜志，2012，32(4):627－630.

[2]中華人民共和國香港特別行政區(qū)衛(wèi)生署中醫(yī)藥事務(wù)部.霉菌毒素(黃曲霉毒素)測定方法[EB/OL].[2005 －09 －01].http://www.cmd.gov.hk/hkcmms/vol1/Docs/Appendix_Ⅶ _Determination_of_Mycotoxins(Aflatoxins)_chi.pdf.

[3]劉 寧，王萌萌，金紅宇，等.高效液相色譜－柱后光化學(xué)衍生法測定參苓白術(shù)散中黃曲霉毒素 G2、G1、B2、B1[J].中國藥事，2012，26(5):442－445.

[4]鄭 榮，毛 丹，王少敏，等.腦立清丸等6種中成藥中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的測定[J].中成藥，2010，32(3):418 －422.

[5]劉亞榮，逯雯潔，劉海清，等.免疫親和柱凈化－柱后光化學(xué)衍生－高效液相色譜熒光法測定飽和系列制劑中黃曲霉毒素[J].中成藥，2012，34(3):678 － 681.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(第二增補(bǔ)本)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2013:187.

[7]郝愛魚，趙麗元，劉英慧，等.HPLC法測定中藥飲片中黃曲霉毒素殘留量的假陽性研究 [J].藥物分析雜志，2013，33(3):458－464.