邰 勝，徐凌凡，徐 明，張陽陽，張 力，梁朝朝

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

Propachlor對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3及LNCaP的作用及其可能機(jī)制

邰 勝1，2，徐凌凡1，徐 明1，張陽陽1，張 力1，2，梁朝朝1，2

目的探討化合物Propachlor對(duì)前列腺癌的作用及可能的分子機(jī)制。方法用梯度濃度的化合物Propachlor處理前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞株；使用CellTiter方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的存活率，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變情況，熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中誘導(dǎo)LC3質(zhì)粒標(biāo)記綠色熒光蛋白（GFP-LC3）的表達(dá)情況。結(jié)果Propachlor可以抑制前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞的存活率，同時(shí)劑量越大腫瘤細(xì)胞存活率抑制越明顯；Propachlor可以誘導(dǎo)PC3及LNCaP腫瘤細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ及自噬小體GFP-LC3的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬效應(yīng)同Propachlor的劑量正相關(guān)。結(jié)論化合物Propachlor具有抗前列腺癌的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)該抗腫瘤效應(yīng)是通過激活細(xì)胞內(nèi)自噬效應(yīng)產(chǎn)生的。

前列腺癌；Propachlor；自噬

前列腺癌是老年男性一種常見的泌尿外科疾病，近年來在我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。同時(shí)有相當(dāng)一部分前列腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為晚期，對(duì)現(xiàn)有的外科及內(nèi)分泌治療效果均不佳；因此，研究開發(fā)出新的晚期前列腺癌治療方法十分必要［1］。通過高通量篩查的方法，發(fā)現(xiàn)一種新的化合物Propachlor，具有抗前列腺癌的生物學(xué)效應(yīng)，分子式見圖1。自噬是細(xì)胞體內(nèi)一種自身蛋白質(zhì)的降解過程，相關(guān)的研究［2］表明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)具有抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)。該研究使用化合物Propachlor處理前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞，觀察化合物Propachlor是否通過激活細(xì)胞內(nèi)自噬效應(yīng)起到抗前列腺癌的生物學(xué)效應(yīng)，為前列腺癌的治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；前列腺癌PC3細(xì)胞由美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校Jiaoti Huang教授提供［3］；化合物Propachlor購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CellTiter購(gòu)自美國(guó)Promega公司；LC3質(zhì)粒標(biāo)記綠色熒光蛋白（green-fluorescent-LC3，GFP-LC3）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗LC3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)GenScript公司；鼠抗β-actin抗體、ECL試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞存活率及生長(zhǎng)曲線 前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞分別在含有5%胎牛血清的DMEM及RPMI培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理LNCaP及PC3細(xì)胞株24 h，使用CellTiter試劑盒裂解細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞ATP，檢測(cè)細(xì)胞的相對(duì)存活率。后再次使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理LNCaP及PC3細(xì)胞株1、2、3、4 d，使用CellTiter的方法測(cè)定腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 Western blot檢測(cè)化合物Propachlor處理后腫瘤細(xì)胞LC3表達(dá) 分別使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理培養(yǎng)后的LNCaP及PC3細(xì)胞株24 h，使用細(xì)胞裂解液（20 mol／L KCl，150 mol／L NaCl，1%NP-40，50 mol／L NaF，50 mol／L TrisHCl，pH＝7.5，1 mol／L DTT，1 mol／L EGTA，1×Protease Inhibitor，10%Glycerol）在冰上裂解細(xì)胞5 min，4℃、1 500 r／min離心15min，使用Bradford Assay試劑盒對(duì)裂解液上清液中蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。等量蛋白的裂解液上樣在15%SDS-PAGE凝膠，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；使用脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉1 h，LC3一抗將封閉的PVDF膜進(jìn)行孵育過夜，PBS洗滌30 min，二抗孵育30 min，PBS洗滌約30 min，采用ECL試劑盒檢測(cè)LC3蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中自噬小體的表達(dá) 腫瘤細(xì)胞使用Lipofectamine 2000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，24 h后更換培養(yǎng)基。分別使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理轉(zhuǎn)染后的LNCaP及PC3細(xì)胞株24 h。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞約30 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，再用DAPI染色15min，熒光顯微鏡下觀察自噬小體的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 化合物Propachlor抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10 μmol／L）處理培養(yǎng)后的前列腺癌LNCaP及PC3細(xì)胞株24 h，發(fā)現(xiàn)隨著Propachlor濃度的增大腫瘤癌細(xì)胞的存活率被抑制的越多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；使用梯度濃度劑量化合物處理前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞1、2、3、4 d后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)一步表明化合物Propachlor可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著Propachlor劑量的增加，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制越顯著，見圖2。

2.2 化合物Propachlor可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬蛋白LC3的表達(dá)隨著濃度的增加腫瘤細(xì)胞中LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)越明顯，表明化合物Propachlor可以誘導(dǎo)前列腺腫瘤細(xì)胞PC3、LNCaP的自噬效應(yīng)，同時(shí)隨著Propachlor劑量的增加誘導(dǎo)自噬的效應(yīng)越明顯，見圖3。

2.3 化合物Propachlor可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬小體GFP-LC3 dots的表達(dá)是自噬小體的一種結(jié)構(gòu)，在熒光顯微鏡下一般分布在細(xì)胞膜周圍呈戒指環(huán)樣結(jié)構(gòu)，也可呈多聚點(diǎn)狀分布。當(dāng)前列腺癌細(xì)胞PC3及LNCaP接受化合物Propachlor處理后可以誘導(dǎo)GFP-LC3的表達(dá)；同時(shí)隨著Propachlor濃度的增加，誘導(dǎo)表達(dá)的GFP-LC3分子越多，表明高劑量的化合物濃度可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的自噬效應(yīng)，見圖4。

3 討論

前列腺癌是歐美男性一種常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)［1］。其中有一部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期前列腺癌，已經(jīng)失去手術(shù)時(shí)機(jī)；同時(shí)絕大多數(shù)前列腺癌患者對(duì)目前的內(nèi)分泌治療及新型分子藥物的治療均會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐受，最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧に氐挚剐郧傲邢侔╟astra-tion resistant prostate cancer，CRPC）［2，4－7］。因此，十分有必要發(fā)現(xiàn)新型的化合物去治療前列腺癌，尤其是晚期前列腺癌CRPC。

通過高通量篩查的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)一種新的化合物Propachlor具有較強(qiáng)的抗前列腺癌的生物學(xué)效應(yīng)，可以明顯抑制前列腺癌細(xì)胞PC3、LNCaP的存活率；對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線也可以明顯抑制。進(jìn)一步研究表明Propachlor對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是通過誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)完成的。自噬發(fā)生過程主要是吞噬需要降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體，并與內(nèi)涵體形成所謂的自噬內(nèi)涵體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新［6－7］。同時(shí)細(xì)胞體內(nèi)的自噬效應(yīng)同細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶－蛋白激酶A-雷帕霉素（PI3K-AKt-mTOR）下游等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)有著密切的相關(guān)性；有研究表明誘導(dǎo)自噬可以起到抗腫瘤的作用，亦有相關(guān)的研究表明抑制自噬也可以起到抑制腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)；認(rèn)為自噬是在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控中起到雙刃劍的作用［8－14］。目前，已有研究［6］表明多種化合物均具有不同程度誘導(dǎo)、抑制細(xì)胞自噬的作用。蛋白LC3為自噬小體形成過程中一種重要的蛋白分子，其生物學(xué)形式具有LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅱ型蛋白具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性；目前普遍認(rèn)為在自噬的形成過程中普遍存在著LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子的轉(zhuǎn)變，因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ分子之間的比例與細(xì)胞體內(nèi)自噬誘導(dǎo)的程度呈正相關(guān)性。

使用梯度濃度劑量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）處理培養(yǎng)后的前列腺癌LNCaP及PC3細(xì)胞株24 h，在PC3及LNCaP細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白的轉(zhuǎn)變，同時(shí)隨著化合物劑量的增加，LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)越明顯，表明化合物Propachlor可以誘導(dǎo)自噬效應(yīng)，自噬的誘導(dǎo)同化合物的濃度劑量呈正相關(guān)性?；衔锞嬖谥嚓P(guān)的細(xì)胞毒性效應(yīng)并且細(xì)胞毒性效應(yīng)與其劑量呈正相關(guān)性，因此對(duì)化合物Propachlor誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的生物學(xué)效應(yīng)仍應(yīng)進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)自噬后自噬體形成最終會(huì)和溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體，自噬溶酶體可聚集形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)；帶有GFP標(biāo)記的LC3蛋白分子在熒光顯微鏡下即可表現(xiàn)出點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)［8］，進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)角度證明化合物Propachlor可以誘導(dǎo)前列腺癌PC3及LNCaP細(xì)胞的自噬效應(yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)的自噬效應(yīng)同化合物的濃度呈正相關(guān)性。前列腺癌為前列腺惡性腫瘤中最為常見的一種病理學(xué)類型，LNCaP細(xì)胞為一種腺癌細(xì)胞可以代表臨床上絕大多數(shù)前列腺惡性腫瘤的生物學(xué)性狀；因此可以進(jìn)一步使用腫瘤患者的前列腺癌細(xì)胞株去檢測(cè)化合物Propachlor抗前列腺癌生物學(xué)效應(yīng)及誘導(dǎo)自噬情況；臨床上有相當(dāng)一部分前列腺癌為CRPC及對(duì)晚期的內(nèi)分泌治療均不佳，有相關(guān)研究［3］表明前列腺癌PC3細(xì)胞具備前列腺小細(xì)胞癌的生物學(xué)特性，因此化合物Propachlor對(duì)前列腺小細(xì)胞癌也可存在通過誘導(dǎo)自噬抗腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)?？梢赃M(jìn)一步建立前列腺癌小鼠動(dòng)物模型，在前列腺癌患者的細(xì)胞中檢測(cè)化合物Propachlor抗腫瘤及誘導(dǎo)自噬的生物學(xué)效應(yīng)，為前列腺癌的治療提供新的策略與新思路。

［1］ Ryan C J，Smith M R，de Bono JS，et al.Abiraterone in metastatic prostate cancerwithout previous chemotherapy［J］.N Engl J Med，2013，368（2）：138－48.

［2］ Loblaw D A，Walker-Dilks C，Winquist E，etal.Systemic therapy in men with metastatic castration-resistant prostate cancer：a systematic review［J］.Clin Oncol（R Coll Radiol），2013，25（7）：406－30.

［3］ Tai S，Sun Y，Squires JM，etal.PC3 is a cell line characteristic of prostatic small cell carcinoma［J］.Prostate，2011，71（15）：1668－79.

［4］ Xu J，Mo Z，Ye D，et al.Genome-wide association study in Chinesemen identifies two new prostate cancer risk lociat9q31.2 and 19q13.4［J］.Nat Genet，2012，44（11）：1231－5.

［5］ Scher H I，F(xiàn)izazi K，Saad F，et al.Increased survival with enzalutamide in prostate cancer after chemotherapy［J］.N Engl J Med，2012，367（13）：1187－97.

［6］ Lian J，Wu X，He F，et al.A natural BH3mimetic induces autophagy in apoptosis-resistant prostate cancer via modulating Bcl-2-Beclin1 interaction at endoplasmic reticulum［J］.Cell Death Differ，2011，18（1）：60－71.

［7］ de Bono JS，Logothetis C J，Molina A，etal.Abiraterone and increased survival inmetastatic prostate cancer［J］.N Engl JMed，2011，364（21）：1995－2005.

［8］ KainiRR，Sillerud LO，Zhaorigetu S，etal.Autophagy regulates lipolysis and cell survival through lipid droplet degradation in androgen-sensitive prostate cancer cells［J］.Prostate，2012，72（13）：1412－22.

［9］ Turner L S，Cheng JC，Beckham TH，et al.Autophagy is increased in prostate cancer cells overexpressing acid ceramidase and enhances resistance to C6 ceramide［J］.Prostate Cancer Prostatic Dis，2011，14（1）：30－7.

［10］Lozy F，Karantza V.Autophagy and cancer cellmetabolism［J］. Semin Cell Dev Biol，2011，23（4）：395－401.

［11］Bhutia SK，Das SK，Azab B，et al.Autophagy switches to apoptosis in prostate cancer cells infected withmelanoma differentiation associated gene-7／interleukin-24（mda-7／IL-24）［J］.Autophagy，2011，7（9）：1076－7.

［12］Turner L S，Cheng JC，Beckham T H，et al.Autophagy is increased in prostate cancer cells overexpressing acid ceramidase and enhances resistance to C（6）ceramide［J］.Prostate Cancer Prostatic Dis，2011，14（1）：30－7.

［13］Jin S，White E.Role ofautophagy in cancer：management ofmetabolic stress［J］.Autophagy，2007，3（1）：28－31.

［14］Shintani T，Klionsky D J.Autophagy in health and disease：a double-edged sword［J］.Science，2004，306（5698）：990－5.

The function and possiblemechanism of Propachlor on anti-prostate cancer LNCaP and PC3 cells

Tai Sheng1，2，Xu Lingfan1，Xu Ming1，et al
（1Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2The Urological Institute of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To explore themechanism of Propachlor anti-prostate cancer.MethodsThe LNCaP and PC3 cellswere treated with Propachlorwith the gradient concentration.The CellTiterwas performed to test the cell variability，and the western blotwas also performed to detect the LC3-Ⅱconversion.The GFP-LC3 was observed under the fluorescencemicroscope.ResultsThe PC3 and LNCaP cells variability was inhibited with the Propachlor，and little cell variability was linked with high concentration Propachlor.The Propachlor might induce the PC3 and LNCaP cells autophagy with LC3-Ⅱconversion and GFP-LC3 dots increase，which was also linked with high concentration Propachlor.ConclusionThe compound Propachlormay be anti-prostate cancer via induction of autophagy among prostate cancer cells.

prostate cancer；Propachlor；autophagy

R 737.25

A

1000－1492（2015）08－1045－04

2015－04－22接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085QH132）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金培養(yǎng)計(jì)劃（編號(hào)：2012KJ13）；國(guó)家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目基金（編號(hào)：2100299）；院內(nèi)博士科研基金（編號(hào)：20120119）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所，合肥 230032

邰 勝，男，醫(yī)師，博士；

梁朝朝，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Liang＿chaozhao＠163.com