王 璐，徐元宏

亞抑菌濃度的抗生素對金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素表達及釋放的影響

王 璐1，2，徐元宏1

目的觀察亞抑菌濃度抗生素對金黃色葡萄球菌（金葡菌）殺白細(xì)胞素（PVL）表達的影響。方法利用PCR篩選出8株P(guān)VL陽性金葡菌。常量稀釋法測定克林霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺和萬古霉素最低抑菌濃度值（MIC）；熒光定量PCR測定前3種抗生素對PVL陽性金葡菌在1／8、1／4、1／2 MIC作用下PVLmRNA相對變化。ELISA法測定4種抗生素1／4、1／2 MIC時PVL蛋白含量。結(jié)果克林霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素在1／8、1／4、1／2 MIC時均可降低PVL表達。PVL mRNA在3種抗生素作用下分別降低17%～82%、8%～85%和11%～78%；PVL蛋白水平在1／4、1／2 MIC克林霉素和利奈唑胺作用下，分別下降了65%和83%、40%和61%，替加環(huán)素僅1／2 MIC時降低較明顯，達64%。萬古霉素不影響PVL表達。結(jié)論不同抗生素亞抑菌濃度時對PVL表達影響不同。克林霉素和利奈唑胺可明顯降低PVL表達，且呈劑量依賴性，替加環(huán)素只在較高濃度時抑制PVL表達，萬古霉素對PVL表達無影響。

金黃色葡萄球菌；殺白細(xì)胞素；亞抑菌濃度

金黃色葡萄球菌（簡稱金葡萄）是一種可產(chǎn)生多種毒素因子并導(dǎo)致人類感染的革蘭陽性球菌。這些毒素中有一種被稱為殺白細(xì)胞素（paton-valentine leukocidin，PVL）的毒力因子，可以引起包括皮膚軟組織感染、壞死性骨髓炎以及病死率極高的壞死性肺炎［1－3］等在內(nèi)的各種疾病。而且，近幾年來不斷涌現(xiàn)出關(guān)于檢測出PVL的報道，說明PVL陽性的金葡菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)播散開來。隨著金葡菌耐藥性的日益增強，臨床上治療金葡菌感染的抗生素選擇范圍也越來越窄，找到可抑制其毒力因子（如PVL）表達釋放的抗生素，將為臨床治療金葡菌感染或是緩解患者感染癥狀提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2013年10月～2014年10月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院從住院患者送檢的各種標(biāo)本分離的385株金黃色葡萄球菌。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）160株，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）225株。PVL陰性和PVL陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株（CCUG46923）均由安徽省立醫(yī)院檢驗科馬筱玲教授惠贈。

1.1.2 試劑和儀器設(shè)備 VITEK32全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；Biometra-Tgradient PCR擴增儀（德國Biometra公司）；DYY-10C凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；NanoDrop 2000濃度儀（美國Thermo Scientific公司）；ABI 7300熒光定量分析儀（美國應(yīng)用生物公司）；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；克林霉素（clindamycin，CLI）、利奈唑胺（linezolid，LZD）購自美國Sigma公司；替加環(huán)素（tigecycline，TGC）以及萬古霉素（vancomycin，VAN）購自美國Cayman公司；酪蛋白水解酵母提取物培養(yǎng)基（casein hydrolysate-yeast extractmedium，CCY）肉湯細(xì)菌總RNA提取純化試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；SYBR?Premix Ex Taq試劑盒（日本TaKaRa公司）；ELISA試劑盒（美國CLOUD-CLONE公司）。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)文獻［4］報道設(shè)計引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。gyrB上游引物：GGTGGCGACTTTGATCTAGC；gyrB下游引物：TTATACAACGGTGGCTGTGC；Luk-pv-F：AATAACGTATGGCAGAAATA TGGATGT；Luk-pv-R：CAAATGCGTTGTGTATTCTA GATCCT。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用普通加熱法粗提DNA，取200μl TAE緩沖液加入到高壓滅菌過的1.5 ml EP管中，挑取血平板18～24 h培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌落3～4個，充分研磨，再加入溶葡萄球菌素10 μl，干式恒溫器100℃加熱15 min，快速冷卻10 min，在低溫高速離心機中以15 000 r／min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌過的EP管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 總反應(yīng)體積為50 μl，10×緩沖液5μl，Taq酶0.25μl dNTP 3μl，引物各1μl，模板3μl，加滅菌去離子水至50μl，反應(yīng)條件：95℃初變性10 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物置4℃冰箱保存。

1.2.3 凝膠電泳 電子天平稱取0.3 g瓊脂糖，加入30 ml TAE緩沖液，微波爐加熱煮沸2 min，加入溴化乙錠（ethidium bromide，EB）液3μl，配成1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，110 V、25 min后置凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

1.2.4 金葡菌MIC值的測量 按照CLIS操作規(guī)程采用常量稀釋法測金葡菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory contentration，MIC）值。

1.2.5 亞抑菌耐藥的誘導(dǎo) 挑取血瓊脂平板上經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h的菌落用水解酪蛋白（MH）肉湯稀釋（添加有50 mg／L的鈣離子和12.5 mg／L的鎂離子），濁度調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。上述菌液于37℃、300 r／min條件下振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液的光密度（optical density，OD）值達2.0麥?zhǔn)蠞岫葧r，將配置好的1／2、1／4、1／8 MIC的克林霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素和萬古霉素加入玻璃培養(yǎng)管中，與未加抗生素的（正常對照組）菌液于37℃條件下振蕩培養(yǎng)。孵育6 h后達到最佳生長濃度時取樣，進行下一步試驗。

1.2.6 熒光定量PCR 按上海生工細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。cDNA合成及實時熒光定量PCR：取上述方法提取的總RNA 2μg，用TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒分別進行逆轉(zhuǎn)錄。PVL為目的基因，gyrB為內(nèi)參基因［4］。按SYBR?Premix Ex Taq試劑盒說明書用熒光染料嵌合法同時檢測PVL和gyrB表達水平，以PVL／gyrB比值反映PVL mRNA表達水平的高低。反映在ABI7300實時熒光PCR儀上進行，試驗重復(fù)3次。

1.2.7 ELISA法定量測定PVL ELISA法分別測量8株P(guān)VL陽性金葡菌在無抗生素及亞抑菌抗生素濃度（1／4、1／2 MIC）時的PVL含量。取含上述亞抑菌耐藥菌株的肉湯，10 000 r／min離心10 min，取上清液，進行ELISA（按說明書操作）實驗，在450 nm波長測量各孔的OD值，每份樣本均設(shè)置2個復(fù)孔。將各抗生素濃度時的PVL含量（μg／L）與無抗生素時測得的含量（μg／L）進行比較（試驗進行3次取平均值）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0軟件進行分析，采用One-Way ANOVA及兩兩比較方法Dunnett-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌PVLPCR產(chǎn)物擴增結(jié)果用PCR法檢測385株金葡菌，顯示3株MRSA和5株MSSA在433 bp處有明顯單一條帶，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果證實，8株金葡菌均為PVL陽性。見圖1。

2.2 8株P(guān)VL陽性的金葡菌MIC值測定對上述PVL陽性菌進行MIC值測定，CLIMIC：0.13～16 mg／L；TGCMIC：0.063～0.250 mg／L；LZD MIC：0.5～2 mg／L；VAN MIC：0.5～2 mg／L。見表1。

表1 8株P(guān)VL陽性金葡菌在CCY肉湯中的M IC值（mg／L）

2.3 抗生素對PVLmRNA表達的影響經(jīng)由8株P(guān)VL陽性菌進行測試，孵育6 h，克林霉素和利奈唑胺從1／8 MIC、1／4 MIC到1／2 MIC對PVLmRNA表達具有很強的劑量依賴性降低作用，克林霉素降低水平從17%～82%不等，利奈唑胺降低了8%～85%不等。替加環(huán)素對6株的PVL mRNA表達具有抑制作用，可降低11%～78%，其中2株金葡菌在1／8 MIC濃度時，PVL mRNA表達量反而輕微增加。1／4 MIC（克林霉素F＝1.92、利奈唑胺F＝2.45）；1／2 MIC（克林霉素F＝2.05、利奈唑胺F＝1.11、替加環(huán)素F＝1.27）；1／8 MIC替加環(huán)素（F＝3.13）。萬古霉素對PVLmRNA表達無影響。見圖2。其中，1／8 MIC TGC，1／4 MIC CLI、LZD、TGC和1／2 MIC CLI、LZD、TGC相較于無抗生素組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 不同亞MIC濃度下PVL陽性金葡菌PVL蛋白含量變化克林霉素和利奈唑胺在1／4 MIC和1／2 MIC及替加環(huán)素的1／2 MIC時相較于無抗生素時，PVL含量的變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）：1／4 MIC（克林霉素F＝1.02、利奈唑胺F＝2.45）；1／2 MIC（克林霉素F＝0.85、利奈唑胺F＝2.11、替加環(huán)素F＝1.97）。萬古霉素作用下，PVL蛋白含量無變化。見圖3、4。

3 討論

亞抑菌濃度的抗生素可以調(diào)控金葡菌毒力因子的表達，影響金葡菌所致感染疾病的轉(zhuǎn)歸。有學(xué)者進行體內(nèi)PVL試驗，結(jié)果表明PVL可以影響壞死組織部位的最低抑菌濃度形成障礙，從而有礙于病原菌的清除和感染灶的修復(fù)。因此本次試驗測定亞抑菌濃度抗生素對PVL表達的影響，以期對嚴(yán)重感染的臨床用藥及日后轉(zhuǎn)歸提供一個新的思路。

經(jīng)檢測385株金葡菌，其中PVL基因陽性有8株，陽性率為2.1%。稍低于同地區(qū)李春等［5］的4.9%。可能本次研究的菌株均是來源于醫(yī)院獲得性金葡菌（hospital acquired Staphylococcus aureus，HA-SA），而李春等［5］選用的標(biāo)本還包括了社區(qū)獲得性金葡菌（community-associated methicillin-resistance Staphylococcus aureus，CA-MRSA），現(xiàn)在已有普遍報道指出CA-MRSA中PVL陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HAMRSA［6－7］。本次實驗顯示，160株MRSA中檢出PVL陽性菌株3株，陽性率為1.9%，225株MSSA中有5株P(guān)VL陽性菌株，陽性率為2.2%。

本次實驗選用了8株分離自臨床標(biāo)本的PVL陽性金葡菌和4種抗生素，結(jié)果顯示，亞抑菌濃度的克林霉素、利奈唑胺和替加環(huán)素均可減少PVL表達，從試驗中可以看出PVL是在mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上進行調(diào)控，從而降低mRNA的翻譯，減少PVL的合成和釋放，這與相關(guān)研究［4，8］結(jié)果相似。8株金葡菌的PVL蛋白合成在替加環(huán)素的作用下全部降低，1／2 MIC時降低達64%。有研究［4］顯示，替加環(huán)素可與金葡菌核糖體30s亞基結(jié)合，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)肽鏈延伸，可能抑制了PVL的合成。試驗中兩種亞抑菌濃度的萬古霉素對PVL蛋白表達影響均不明顯。

利奈唑胺作為新型抗生素，用于治療包括MRSA引起的院內(nèi)和社區(qū)獲得性肺炎、復(fù)雜性皮膚軟組織感染。Elisabeth et al［9］認(rèn)為利奈唑胺對治療PVL陽性的MRSA和MSSA均有效，并且報道了3例PVL陽性金葡菌感染病例，臨床均給予克林霉素和利奈唑胺聯(lián)合治療，3種感染均得到治愈，并且預(yù)后良好。

替加環(huán)素是用于成人復(fù)雜皮膚及軟組織感染和腹內(nèi)感染的新型抗生素，美國外科感染協(xié)會尤其指出替加環(huán)素應(yīng)當(dāng)用于進展較快的由金葡菌引起的皮膚軟組織感染［10］。

如今細(xì)菌耐藥率不斷上升以及超級細(xì)菌的出現(xiàn)，尋找合適的替代萬古霉素的抗生素顯得尤為重要。Puzniak et al［11］對替加環(huán)素和萬古霉素在治療金葡菌感染中的作用同時進行評估，發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素在治療MRSA引起的皮膚軟組織感染時，作用等同于萬古霉素，而且有研究［12－13］表明萬古霉素在治療嚴(yán)重MRSA感染時發(fā)揮的作用正逐漸減小。因此，可以認(rèn)為在治療PVL陽性金葡菌引起的皮膚軟組織及包括切口放置物引起的外科感染時，替加環(huán)素或可做為首選用藥。

本研究是國內(nèi)首次報道PVL在亞抑菌濃度抗生素作用下的合成及釋放，但由于目前CA-MRSA中PVL陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HA-MRSA，因此應(yīng)當(dāng)繼續(xù)收集門診患者的金葡菌標(biāo)本，選取更多樣的抗生素，以期為臨床治療PVL陽性的金葡菌感染提供更多的方法。

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Effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on Staphylococcus aureus producing panton-valentine leukocidin

Wang Lu1，2，Xu Yuanhong1
（1Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001，2Clinical Laboratory Center，Lu′an People′s Hospital，Lu’an 237005）

Objective To explore the effect of subinhibitory concentrations（sub-MICs）of four antibiotics on panton-valentine leucocidin（PVL）expression by Staphylococcus aureus.MethodsEight strains of PVL-positiveStaphylococcus aureus were isolated by PCR.The MICs of these antibiotics were determined by constant dilution. then，PVL expression of Staphylococcus aureus wasmeasured at differentMICs of these antibiotics by ELISA.ResultsClindamycin，linezolid and tigecycline all could reduce the expression of PVL at1／8 MIC～1／2 MIC.after 4 and 6 hours of culturing，the relative PVL mRNA expression was reduced about 17%～82%，8%～85%and 11%～78%by clindamycin，linezolid and tigecycline，respectively.The protein expression of PVLwas reduced by 65%and 83%under1／4 and 1／2 MIC of clindamycin，and reduced by 40%and 61%under1／4 and 1／2MIC of linezolid，and reduced by 61%only at1／2 MIC of tigecycline.There had no effect of vancomycin on PVL expression.ConclusionThe effects of four antibiotics on PVL expression at sub-MICs were different.Clindamycin and linezolid could significantly reduced PVL expression.Tigecycline colud reduced PVL expression only at high sub-MICs.Vancomycin had no effect.

Staphylococcus aureus；panton-valentine leucocidin；subinhibitory concentrations

R 446.5

A

1000－1492（2015）08－1086－05

2015－04－29接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81171606）；安徽省科技廳臨床檢驗技術(shù)公共服務(wù)平臺項目（編號：PT20081011）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022

2六安市人民醫(yī)院檢驗科，六安 237005

王 璐，女，碩士研究生；

徐元宏，男，教授，主任技師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xyhong1964＠163.com