夏 明，黃衛(wèi)人，蔡志明

長鏈非編碼RNA HOTAIR對腎癌細胞增殖和凋亡的影響

夏 明1，2，黃衛(wèi)人2，蔡志明1，2

目的探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）HOTAIR對腎癌細胞系786-O和ACHN增殖和凋亡的影響。方法兩種細胞系轉(zhuǎn)染針對HOTAIR的小干擾RNA（siRNA），利用qRT-PCR檢測干擾效率，再分別以噻唑藍（MTT）法、ELISA法和Hochest染色法檢測HOTAIR表達降低后786-O和ACHN細胞在增殖和凋亡方面的變化。結(jié)果siRNA可有效降低HOTAIR表達（P＜0.05）；減少HOTAIR含量可顯著抑制兩種細胞的增殖（P＜0.05），同時增加細胞凋亡（P＜0.05）。結(jié)論HOTAIR具有促進腎癌細胞生長的作用。

腎癌；長鏈非編碼RNA；HOTAIR；細胞增殖；細胞凋亡

腎癌是一種常見泌尿系統(tǒng)腫瘤，占成人腫瘤發(fā)病率3%［1］，且近年來發(fā)病率增長幅度最高。目前，早中期腎癌主要利用手術(shù)治療［2］，但仍有1／3腎癌患者屬于晚期，對放、化療不敏感［3］。因此，深入探索腎癌發(fā)生的詳細分子機制將對腎癌早期診斷及中晚期治療具有重要益處。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本大小長于200個核苷酸的不翻譯RNA，在人類基因組中，保守估計大約有23 000個LncRNA［4］。LncRNA可在多個水平如轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳等調(diào)控基因表達，參與物種進化、細胞分化、器官形成、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝等基礎(chǔ)生命活動，并參與惡性腫瘤等多種疾病發(fā)生［5］。HOTAIR（hox transcriptantisense intergenic RNA）是一種研究較多的LncRNA，其異常表達與乳腺癌、肝癌、食管癌和肺癌等多種腫瘤相關(guān)，提示其是一種重要的癌癥發(fā)生相關(guān)因子［6－9］。該研究旨在體外觀察HOTAIR對腎癌細胞生長的影響，如細胞增殖、凋亡的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人腎癌細胞系786-O和ACHN均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。

1.1.2 試劑 Lipofectamine 2000、TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）、DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰氨、青霉素－鏈霉素混合液胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（美國Sigma aldrich公司）、人胱天蛋白酶3（Caspase-3）ELISA檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；人HOTAIR-siRNA（5’-UUAAGUCUAGGAAUCAGCACGAAGC-3’）、陰性對照（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）（上海吉瑪公司）。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機（美國Sigma公司）、NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司）、Thermal Cycler C1000 PCR儀（美國BIO-RAD公司）、Light Cycler 480II實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）、THZD型臺式恒溫振蕩器（江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠）、DTX880熒光檢測儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)人腎癌細胞786-O、ACHN培養(yǎng)于含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素－鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，常規(guī)消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期細胞接種于6孔、96孔或24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁且融合度達到40%～60%時，將HOTAIR-siRNA、陰性對照序列（NC）分別由Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入細胞，置37℃孵育6 h，隨后棄轉(zhuǎn)染液，換10%FBS的正常DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測HOTAIR表達量收集轉(zhuǎn)染后48 h細胞，按TRIzol試劑說明書提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)條件及

2015－04－29接收

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（編號：2014CB745200）；國家自然科學(xué)基金（編號：81272840）；國家自然科學(xué)青年基金（編號：81201579）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市第二人民醫(yī)院臨床學(xué)院，深圳518035

2深圳市第二人民醫(yī)院泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤研究重點實驗室和醫(yī)學(xué)重編程技術(shù)重點實驗室，深圳 518035

作者簡介：夏 明，男，碩士研究生；

蔡志明，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：caizhiming2000＠163.com

參數(shù)，以GAPDH為內(nèi)參，進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及qRT-PCR擴增。引物序列均由華大基因合成，HOTAIR上游引物：5’-GGGTGGCTCACTCTTCTGGC-3’，下游引物：5’-TGGCCTTGCCCGGGCTTGTC-3’；GAPDH上游引物：5’-CGCTCTCTGCT CCTCCTGTTC-3’，下游引物：5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。采用2

－ΔΔCt

法進行分析，ΔCt＝Ct

HOTAIR

Ct

GAPDH

，ΔΔCt＝（Ct

HOTAIR

-Ct

GAPDH

）干擾組－（Ct

HOTAIR

Ct

GAPDH

）對照組。

1.5 MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，24 h后轉(zhuǎn)染，設(shè)置兩組，陰性對照組（NC組）和HOTAIR轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h進行MTT檢測。實驗終止前4 h加入MTT溶液10μl／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150μl／孔，震蕩10 min后，在酶標儀波長490 nm處檢測各孔光密度（optical density，OD）值。計算并統(tǒng)計生長抑制率（growth inhibitory rate，GIR，%）＝1－（ODHOTAIR／ODNC）× 100%。

1.6 ELISA法檢測細胞凋亡在24孔板中接種對數(shù)生長期細胞，24 h后按對照組及干擾組進行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細胞，用PBS重懸后反復(fù)凍融致細胞裂解。將細胞裂解液加入已經(jīng)包被Caspase-3抗體的聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中，37℃孵育30 min，棄液后洗板3次，再加入辣根過氧化物酶標記工作液，37℃孵育30 min，棄液再洗板5次后加入底物溶液，避光顯色20 min，最后加入終止液。反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長下測量每孔OD值，OD值大小可以間接反映Caspase-3的酶活性，進而說明細胞凋亡程度。

1.7 Hoechst33342染色檢測細胞凋亡將對數(shù)生長期細胞接種于12孔板（內(nèi)含細胞爬片），24 h后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后取出PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，去固定液，再用PBS洗1～2次，加入Hoechst33342染色液，染色5～15 min，再用PBS洗2次，將爬片取出，反蓋在滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，稍晾干后熒光顯微鏡下觀察拍照，再統(tǒng)計被致密藍染的凋亡細胞。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，上述實驗均重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。圖表用GraphPad Prism 5.0生成。

2 結(jié)果

2.1 siRNA可顯著降低細胞內(nèi)HOTAIR表達在腎癌細胞株786-O與ACHN內(nèi)，與對照組相比，干擾組細胞內(nèi)HOTAIR表達均降低，分別為對照組的25.13%及40.84%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.05、5.94，P＜0.05），見圖1。表明轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA可成功下調(diào)786-O及ACHN細胞內(nèi)HOTAIR的表達。

2.2 下調(diào)HOTAIR表達可抑制786-O和ACHN細胞增殖MTT法結(jié)果顯示，HOTAIR siRNA轉(zhuǎn)染786-O細胞后24、48、72 h較對應(yīng)時間對照組OD值明顯降低（t24h＝4.294，t48h＝88.00，t72h＝15.68；P＜0.05）。抑制率最高可達（28.16±1.18）%。見圖2A。HOTAIR siRNA干擾ACHN細胞后24、48、72 h較對應(yīng)時間點對照組OD值明顯降低（t24h＝83.66，t48h＝24.58，t72h＝24.48；P＜0.05），抑制率最高可達（35.27±5.95）%。見圖2B。

2.3 下調(diào)HOTAIR表達可增加786-O和ACHN的細胞凋亡在腎癌細胞786-O及ACHN中，siRNA干擾組的Caspase-3相對活性分別為對照組的1.49倍（t＝6.309，P＜0.01）及1.50倍（t＝9.075，P＜0.05）。見圖3。

Hoechst染色法檢測顯示，上述兩個細胞系中，HOTAIR siRNA干擾組相比于對照組的凋亡細胞均顯著增多，見圖4。統(tǒng)計后，786-O細胞系干擾組凋亡率是對照組的1.67倍（t＝19.42，P＜0.05），而ACHN細胞系內(nèi)干擾組凋亡率是對照組的2.49倍（t＝19.15，P＜0.01），見圖5。

3 討論

HOTAIR是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的LncRNA，僅存在于哺乳動物。人的HOTAIR全長2158堿基，基因定位于染色體12q13.13的HOXC11與HOXC12之間，包括6個外顯子［10］。研究［6－9］表明HOTAIR對乳腺癌、肝癌、食管癌、肺癌等癌細胞體外增殖和凋亡有重要影響，尚未有腎癌方面的報道。已有研究［11］顯示HOTAIR在多個腎癌細胞系中存在高表達，由此推斷，HOTAIR也可能對腎癌細胞生長有重要影響。

本研究結(jié)果顯示HOTAIR表達下調(diào)可顯著抑制細胞增殖，同時增加細胞凋亡，從而意味著HOTAIR是一種重要的腎癌細胞生長正調(diào)控因子，扮演著“癌基因”的角色，這與HOTAIR在其他腫瘤中的作用相一致。因此，深入研究HOTAIR促進腎癌細胞生長機制對理解腎癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義。

前期研究［12］表明，HOTAIR可結(jié)合哺乳動物多梳蛋白抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex2，PRC2）和組蛋白去甲基化酶復(fù)合體（LSD1／REST）并發(fā)揮腳手架作用，即其5’端和PRC2結(jié)合，而其3’端和LSD1復(fù)合物結(jié)合。PRC2由甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、SUZ12和EED三亞基組成，其中起主要作用的EZH2亞基可催化組蛋白H3第27位賴氨酸（histone H3 lysine K27，H3K27）甲基化，生成H3K27me3（轉(zhuǎn)錄抑制標志），進而招募PRC2至特定位點沉默HOXD基因座及相關(guān)抑制基因如HOXD10、JAM2、PCDH10等轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)［13］。前期研究［14］還表明在EZH2與HOTAIR結(jié)合區(qū)域和EZH2與BRCA1結(jié)合區(qū)域存在重疊，因此HOTAIR可競爭性抑制BRC1與EZH2的結(jié)合，這種競爭性結(jié)合在染色質(zhì)水平上調(diào)節(jié)PRC2依賴性的基因轉(zhuǎn)錄。此外，HOTAIR與EZH2的結(jié)合還依賴于EZH2的磷酸化修飾［15］。EZH2的蘇氨酸殘基345（T345）和487（T487）可被細胞周期依賴性蛋白激酶CDK1和CDK2磷酸化，而EZH2-T345磷酸化可增強HOTAIR與EZH2的親和力，該位點的突變可破壞HOTAIR與EZH2的相互作用。總之，HOTAIR主要通過影響特定基因位點H3K27甲基化狀態(tài)而影響基因表達，最終促進腫瘤細胞的增殖、抑制細胞凋亡。本實驗亦初步顯示下調(diào)HOTAIR表達，腎癌細胞ACHN和786-O中HOXD10基因啟動子上游H3K27me3含量顯著降低，但尚需進一步驗證（數(shù)據(jù)未提供）。

綜上所述，本實驗確定了LncRNA HOTAIR對腎癌細胞增殖的正調(diào)控作用，為腎癌的診斷和治療提供了新的候選分子，為進一步研究分子機制奠定了基礎(chǔ)。

（致謝：此文章獲得深圳市醫(yī)療衛(wèi)生“三名工程”資助）

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Effect of long non-coding RNA HOTAIR on the proliferation and apoptosis of renal cancer cells

Xia Ming1，2，HuangWeiren2，Cai Zhiming1，2
（1Shenzhen Second Hospital Clinical School of Anhui Medical University，Shenzhen 518035，2Shenzhen Key Laboratory of Genitourinary Tumor and Key Laboratory of Medical Reprogramming Technology，Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen）

Objective To investigate the effect of long non-coding RNA（LncRNA）Hox transcript antisense intergenic RNA（HOTAIR）on the cell proliferation and apoptosis of renal cancer cell lines 786-O and ACHN. Methods Small interfere RNA（siRNA）thataims to down-regulate HOTAIR expression was transfected into tworenal cell lines respectively，and the transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR.Then the MTT assay，Hochest staining assay and enzyme-linked immunosorbnent assay（ELISA）were used to detect cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of HOTAIR could be down-regulated effectively by the siRNA（P＜0.05）. Down-regulation of HOTAIR could inhibit the proliferation（P＜0.05）and increase apoptosis（P＜0.05）of two renal cancer cells.ConclusionHOTAIR plays a role in promoting cell growth of renal cancer.

renal cancer；long non-coding RNA；HOTAIR；cell proliferation；apoptosis

R 737.11

A

1000－1492（2015）08－1095－05