宋先兵，張 寶，黃焱平，安 梅，方安寧，陳曉宇

◇藥學(xué)研究◇

白藜蘆醇對大鼠腎臟缺血－再灌注損傷保護(hù)作用研究

宋先兵1，張 寶2，黃焱平1，安 梅1，方安寧1，陳曉宇3

目的觀察白藜蘆醇（RES）對大鼠腎臟缺血－再灌注（I／R）保護(hù)作用并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法SD大鼠隨機(jī)分為4組：空白對照組、I／R模型組、白藜蘆醇（RES）處理組、RES＋I(xiàn)R模型組；檢測各組大鼠血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）及腎臟病理學(xué)改變，使用超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒檢測腎臟組織SOD、MDA、GSH-PX產(chǎn)生；Western blot法檢測腎臟組織p-AKT蛋白水平。結(jié)果與空白對照組相比，I／R模型組Cr、BUN含量均有升高，與I／R模型組相比，RES＋I(xiàn)／R模型組Cr、BUN含量均有明顯下降；病理學(xué)檢測顯示RES＋I(xiàn)／R模型組腎臟損傷較I／R模型組明顯減輕，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，基底膜稍有增厚；與空白對照組相比，I／R模型組SOD、MDA、GSH-PX含量均有升高，與I／R模型組相比，RES＋I(xiàn)／R模型組SOD、GSH-PX含量均有明顯下降；Western blot檢測顯示，與空白對照組相比，I／R模型組p-AKT表達(dá)水平有所降低，但RES可提高p-AKT表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論RES通過氧化應(yīng)激保護(hù)I／R腎臟損傷，其作用機(jī)制可能與PI3K／AKT信號通路活化有關(guān)。

白藜蘆醇；缺血－再灌注；氧化應(yīng)激；AKT

白藜蘆醇（resveratol，RES）是植物體內(nèi)一種天然的二苯乙烯類多環(huán)基酚化物質(zhì)，化學(xué)名為3，4，5-三羥基酚，研究［1－2］表明，RES可對腫瘤、缺血、動脈粥樣硬化等多種疾病具有良好的治療作用。其保護(hù)及治療機(jī)制可能由于RES是一種抗自由基抗氧化劑，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚［3］。腎臟缺血－再灌注（ischemia-reperfusion，I／R）損傷是臨床上導(dǎo)致缺血性急性腎衰竭的主要原因之一，病死率高，且存活的患者也會伴有不同程度的慢性腎功能損害［4］。脂質(zhì)過氧化是I／R導(dǎo)致腎臟組織損傷的重要機(jī)制，因此尋找積極有效的脂質(zhì)過氧化治療藥物，保護(hù)腎臟細(xì)胞免受過度氧化應(yīng)激的損傷，對保護(hù)I／R過程產(chǎn)生的腎臟損害具有重要意義［5］。該研究觀察RES治療后腎臟I／R的保護(hù)作用及其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康雄性SD大鼠40只，250～300 g，SPF級，購自安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 主要試劑與儀器RES、戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗大鼠p-AKT抗體（美國CST公司）。Universal 320／320R型低溫高速離心機(jī)（德國Hettich公司）；μQuant酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；AUW 220D電子分析天平（日本島津公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組（10只）、I／R模型組（10只）、RES預(yù)處理組（10只）、RES＋I(xiàn)／R模型組（10只）。

1.3.2 大鼠I／R模型制備 模型組動物以2%戊巴比妥納（0.25 ml／100 g）腹腔注射麻醉，腹部正中切口暴露腹腔，小心分離雙側(cè)腎蒂，以無創(chuàng)動脈夾關(guān)閉左側(cè)腎動脈1 h，然后開放動脈血流，同時(shí)切除右側(cè)腎臟。開放血流后腎臟由暗紅變?yōu)轷r紅，表明再灌注成功，縫合腹腔。并于缺血24 h處死動物，股動脈取血，留取腎臟標(biāo)本［6－7］。RES治療組于建模前1 h腹腔注射RES（3 mg／kg）進(jìn)行預(yù)處理［8］；空白對照組不做任何處理；RES預(yù)處理組與RES治療組處理相同，但不建立I／R模型。于造模24 h后麻醉處死各組大鼠。

1.4 病理學(xué)檢測及評分各組大鼠處死后，取左側(cè)腎臟組織，將少量組織固定于10%甲醛中，固定48

2015－04－08接收

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81373421）

作者單位：1安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校人體解剖與組織胚胎教研室，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，合肥 230022

3安徽醫(yī)科大學(xué)組胚教研室，合肥 230032

作者簡介：宋先兵，男，講師，碩士；

陳曉宇，男，博士，教授，責(zé)任作者，E-mail：cxyayd＠163. com

h后制作蠟塊，制成5μm切片，采用蘇木精－伊紅（HE）染色法觀察小鼠腎臟的病理變化。病理評分方法參照文獻(xiàn)

［9］

，鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡形成和脫化等，評分等級分為0～5分，分別為：0分（無）；1分（≤10%）；2分（11%～25%）；3分（26%～45%）；4分（46%～75%）；5分（≥76%）。

1.5 腎功能及臟器系數(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠處死后，腹主動脈取血，4 000 r／min離心10 min，離心半徑為87 mm，取血清，脲酶法檢測肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。各實(shí)驗(yàn)組大鼠處死后，取血后頸椎脫臼處死動物，迅速摘取左側(cè)腎臟，冷生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。計(jì)算方法：臟器系數(shù)（%）＝臟器重量／體重×100%。

1.6 生化指標(biāo)測定大鼠再灌注24 h后將大鼠處死，取部分腎臟組織制備勻漿，分別按照試劑盒操作方法測定腎臟組織SOD、MDA、GSH-PX含量。

1.7 W estern blot法測定p-Ak t蛋白表達(dá)稱取凍存腎臟樣品0.1 mg，冰浴，加入500μl組織裂解液，冰浴勻漿，4℃、12 000 r／min離心10 min，收集上清液50 m l，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入4×Loading buffer與上清液混勻變性10 min，每個(gè)樣品的總蛋白為20μg上樣，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳（濃縮膠為5%，分離膠為12.5%），后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗封閉4℃過夜，PBST（PBS＋吐溫-20），洗膜3次，每次10 min；二抗（1∶20 000）室溫孵育12 h（羊抗兔），PBST漂洗后，用ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)，使用IPP 6.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用最小顯著性差數(shù)法（LSD法）。

2 結(jié)果

2.1 腎功能及臟器系數(shù)檢測結(jié)果 空白對照組與RES預(yù)處理組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與空白對照組相比，I／R模型組Cr、BUN含量及臟器系數(shù)均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與IR模型組相比，RES＋I(xiàn)R模型組Cr、BUN含量及臟器系數(shù)均有明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 病理學(xué)檢測結(jié)果各組大鼠腎臟組織病理圖片見圖1，空白對照組與RES預(yù)處理組可見清晰的腎小球結(jié)構(gòu)，基底膜未見明顯增厚和融解，無粘連變性現(xiàn)象，細(xì)胞間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤，I／R模型組大鼠腎臟均出現(xiàn)不同程度的損傷現(xiàn)象，鏡下可見腎皮質(zhì)內(nèi)腎小囊消失，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性改變，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤和球旁器增生等病理改變，RES＋I(xiàn)R模型組腎臟損傷較I／R模型組明顯減輕，腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，基底膜稍有增厚。

2.3 各組大鼠腎臟SOD、MDA及GSH-PX含量

空白對照組與RES預(yù)處理組相比，各指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05），與空白對照組相比，I／R模型組SOD、MDA、GSH-PX含量均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與IR模型組相比，RES＋I(xiàn)／R模型組SOD、GSH-PX含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腎臟組織p-AKT蛋白表達(dá)情況與空白對照組相比，I／R模型組p-AKT表達(dá)水平有所降低，但RES提高p-AKT表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1 863.872，P＜0.05）。見圖2。

3 討論

RES是一種天然的蒽醌萜類化合物，是近年來研究較多的一種植物抗毒素，可從虎杖等根莖中提取，具有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及保護(hù)心血管等作用，其作用機(jī)制涉及抑制脂質(zhì)過氧化、抑制血小板聚集合組織因子的表達(dá)、促進(jìn)血管舒張等［10］。

腎臟I／R在臨床疾病及治療中有時(shí)難以避免，如腎動脈手術(shù)、腎移植、心跳驟停、高血壓和休克等。I／R引起的腎臟損傷最主要的是發(fā)生在缺血后再灌注階段。其機(jī)制可能是再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧自由基產(chǎn)物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激炎性損傷和臟器功能障礙［11］?？寡趸委熞驯蛔C實(shí)對腎臟I／R損傷具有保護(hù)作用，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，體內(nèi)的抗氧化能力減弱，具有清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的抗氧化酶如SOD、GSH-PX，從而導(dǎo)致ROS的過度積聚［12］。SOD是體內(nèi)唯一能夠直接清除氧自由基的酶，對腎組織抵御自由基的損傷發(fā)揮著重要作用，同時(shí)GSH-PX的降低提示組織氧化應(yīng)激的過度激活和抗氧化能力下降。體內(nèi)大量的ROS能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)其脂質(zhì)過氧化，從而形成大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如MDA等。研究［13］顯示MDA能直接反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，并可反映組織細(xì)胞氧化損傷的程度。本研究顯示，使用RES治療腎臟I／R后，大鼠腎臟組織SOD和GSH-PX含量相對增多，MDA生產(chǎn)明顯降低，表明RES具有較好地清除細(xì)胞內(nèi)氧化毒性物質(zhì)的能力，且具有促進(jìn)SOD產(chǎn)生的作用。

表1 各組大鼠腎臟功能及臟器系數(shù)檢測結(jié)果＝10）

表1 各組大鼠腎臟功能及臟器系數(shù)檢測結(jié)果＝10）

與空白對照組比較：*P＜0.05；與RES＋I(xiàn)R模型組比較：＃P＜0.05

項(xiàng)目空白對照組I／R模型組RES預(yù)處理組RES＋I(xiàn)R模型組F值Cr（μmol／L）93.20±13.74 252.50±31.88*＃98.39±12.45 116.33±18.32*81.096 BUN（mmol／L）8.86±0.75 11.55±1.76*＃8.48±0.85 9.58±0.91 2.461臟器系數(shù)（%）0.74±0.08 0.99±0.12*＃0.80±0.11 0.82±0.05*11.613

表2 各組大鼠腎臟SOD、MDA及GSH-PX含量比較，n＝10）

表2 各組大鼠腎臟SOD、MDA及GSH-PX含量比較，n＝10）

與空白對照組比較：*P＜0.05；與RES＋I(xiàn)R模型組比較：＃P＜0.05

項(xiàng)目空白對照組I／R模型組RES預(yù)處理組RES＋I(xiàn)R模型組F值SOD（mg／g）84.68±5.78 61.06±89.02*＃86.34±4.49 71.74±5.86a*17.352 MDA（U／mg）1.86±0.13 2.52±0.25*＃1.95±0.16 2.11±0.35 9.874 GSH-PX（mmol／g）6.35±0.50 3.32±0.64*＃7.16±0.19 5.07±0.32*69.004

PI3K／AKT是一條經(jīng)典的存活信號通路，在細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。PI3K可以使其下游分子Akt磷酸化。研究［14］顯示RES可以通過降低受氧化應(yīng)激刺激的HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA產(chǎn)生、提高SOD生成、促進(jìn)Nrf2蛋白表達(dá)來發(fā)揮氧化應(yīng)激能力，且這一作用的機(jī)制可能與活化PI3K／AKT通路有關(guān)；同時(shí)，PI3K／AKT信號通路及氧化應(yīng)激在大鼠腦I／R損傷中發(fā)揮重要作用［15］。本研究顯示RES能夠減輕I／R過程中的腎臟損傷，同時(shí)RES可提高p-AKT水平。

綜上所述，推測RES可保護(hù)I／R腎臟損傷，主要是由于其SOD和GSH-PX含量相對增多，MDA產(chǎn)生明顯降低來發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激能力，且這一作用機(jī)制可能與PI3K／AKT活化有關(guān)。

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Resveratol protects on renal ischem ical-reperfusion injury in rats

Song Xianbing1，Zhang Bao2，Huang Yanping1，et al
（1Dept of Human Anatomy and Histology and Embryology，AnhuiMedical College，Hefei 230601；2Deptof Clinical Nutrition，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the protective effects of resveratrol（RES）on renal ischemia-reperfusion（I／R）injury and explore its possible mechanisms in rats.MethodsThe SD rats were randomly divided into four groups：blank control group，I／R model group，RES pretreatment group and RES＋I(xiàn)R model group.We detected the contents of serum creatinine（Cr），blood urea nitrogen（BUN）and renal pathology in rat serum.Superoxide dismutase（SOD）activity stress，malondialdehyde（MDA）and glutathione peroxidase（GSH-PX）kitwere used to detect renal SOD，MDA，GSH-PX contents.We detected the level of p-AKT protein in renal tissue by western blot.ResultsCompared to the blank control group，the contents of Cr and BUN were increased in I／R model group.But compared to the I／Rmodelgroup，the contents of Cr and BUN were decreased significantly in RES＋I(xiàn)／Rmodel group.Pathology detection found that kidney damage reduced significantly in RES＋I(xiàn)／Rmodel group compared with I／Rmodel group，such as glomerular structure presenting basically normal，stromal cells presenting a few infiltration and basement membrane slightly thickened.Compared to the blank control group，SOD，MDA，GSH-PX contentswere increased in I／Rmodel group.But compared to I／R model group，SOD，MDA，GSH-PX were decreased significantly in RES＋I(xiàn)／R model group.Compared to the blank control group，the expression of p-AKTwas decreased in I／Rmodel group，and we also found that resveratrol could increase the level of AKT phosphorylation，the difference was statistically significant.ConclusionResveratrol protects I／R renal injury via oxidative stress，and themechanism may be related with the activation of PI3K／AKT signal pathway.

resveratol；ischemia reperfusion；oxidative stress；AKT

R 692

A

1000－1492（2015）08－1111－04