張俊峰，靳 穎，徐 亮，程 帥，王冬梅，王彥春，魏殿軍

羧基化聚乙烯基萘納米微球的制備和應(yīng)用

張俊峰1，靳 穎2，徐 亮3，程 帥3，王冬梅3，王彥春1，魏殿軍1

以乙烯基萘（VN）為聚合單體，采用乳液聚合法制備聚乙烯基萘（PVN）納米微球。通過(guò)對(duì)其羧基化與β2微球蛋白（β2-M）抗體偶聯(lián)，制成免疫檢測(cè)試劑。分別用聚苯乙烯（PS）和PVN檢測(cè)試劑測(cè)定β2-M含量，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，對(duì)自制的PVN納米微球膠乳增強(qiáng)免疫比濁（LETIA）檢測(cè)試劑的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。自制的羧基化PVN納米微球免疫試劑成功對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣本進(jìn)行了檢測(cè)并在一定范圍內(nèi)有較好的線性，比PS檢測(cè)試劑更加靈敏。利用該研究采用的方法和條件可以成功制備粒徑大小可控、單分散的羧基化PVN納米微球，是比PS更優(yōu)的LETIA新載體，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

乙烯基萘；膠乳增強(qiáng)免疫比濁法；β2微球蛋白；納米微球

乳液聚合是微球制備最常用的方法，主要以水為分散介質(zhì)［1］，需要氮?dú)獾谋Ｗo(hù)；乳液聚合無(wú)污染或低污染，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥等方面得到了廣泛應(yīng)用［2－4］，是最常使用的免疫分析方法之一。迄今，膠乳增強(qiáng)免疫比濁（latex enhanced turbidimetric immunoassay，LETIA）在臨床中已經(jīng)應(yīng)用于C反應(yīng)蛋白［4］、胱抑素C［5］、前列腺特異性抗原［6］等涉及炎癥、肝腎功能、腫瘤等多個(gè)領(lǐng)域項(xiàng)目的檢測(cè)。目前LETIA檢測(cè)試劑多以聚苯乙烯（polystyrene，PS）納米微球?yàn)檩d體，該基質(zhì)小粒徑PS微球偶聯(lián)抗體量大，可以保證較大線性范圍，然而透光率低，靈敏度較差；大粒徑PS微球可以提升靈敏度，但偶聯(lián)抗體量減小，線性范圍相對(duì)變窄［7］。該研究采用乳液聚合法首次成功制備了羧基化聚乙烯基萘（polyvinyl naphthalene，PVN）納米微球，可利用較小粒徑微球偶聯(lián)較大量抗體，在提供較好靈敏度的同時(shí)又保證有較大的線性范圍，將其用作LETIA檢測(cè)試劑的載體，有很好的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器乙烯基萘（vinyl naphthalene，VN），分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），電泳級(jí)，購(gòu)自天津聯(lián)星生物公司；過(guò)硫酸鉀（potassium persulfate，KPS），分析純，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；丙烯酸鈉（95%）購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC 99%］、BSA 99%購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS 99%）購(gòu)自美國(guó)Pierce試劑公司；β2微球蛋白（β2-M）及其抗體（IgG 99%）購(gòu)自深圳菲鵬生物科技有限公司；羧基化PS納米微球購(gòu)自伊普西?。ㄕ憬鸢玻┥锟萍加邢薰?；DelsaTMNano C納米粒度及zeta電勢(shì)分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；380型傅里葉變換紅外光譜儀購(gòu)自美國(guó)Nicolet公司；XL30環(huán)境掃描電子顯微鏡購(gòu)自荷蘭Philips公司；H7180大型生化分析儀和U-3310分光光度計(jì)購(gòu)自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 羧基化PVN納米微球的制備 利用乳液聚合法制備羧基化PVN納米微球。稱量0.04～0.15 g乳化劑SDS加入50 ml錐形瓶中，加入碳酸鹽緩沖溶液和引發(fā)劑KPS溶液，然后加入VN單體；采用化學(xué)鍵合的方法，加入丙烯酸鈉；在微球表面引入羧基，進(jìn)行功能基化改性，以利于該微球的后續(xù)應(yīng)用。通氮?dú)?0～15 min，密封，振搖乳化10～15 min。最后放入80℃水浴搖床中120 r／min振搖10 h。使用經(jīng)過(guò)處理的透析袋以蒸餾水為透析液透析制備所得的已知粒徑的微球3 d，除去微球中反應(yīng)后剩余的單體及其他副反應(yīng)物，將此微球保存于4℃冰箱中，待用。

1.2.2 羧基化PVN納米微球的表征方法 用DelsaTMNano C納米粒度及zeta電勢(shì)分析儀測(cè)量羧基化PVN納米微球的粒徑以及單分散系數(shù)（particle dispersion index，PDI）；采用溴化鉀（KBr）壓片的方法在380型傅里葉變換紅外光譜儀上檢測(cè)羧基化PVN微球是否連上羧基；用XL30環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察納米微球的表面形貌；用U-3310分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)量羧基化PVN納米微球的吸光度（absorbance，A），并與同等粒徑的羧基化PS對(duì)比。

1.2.3 β2-M-LETIA檢測(cè)試劑的制備 取羧基化PS納米微球和羧基化PVN納米微球各適量，分別依次向其中加入等量EDC和NHS對(duì)表面進(jìn)行活化，室溫放置15 min。然后迅速加入等量的β2-M抗體，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)3 h。取出反應(yīng)物后采用切向流過(guò)濾除去游離的β2-M抗體，收集上清液，用于定量鍵合抗體量。下層物質(zhì)加BSA封閉12 h，即可得到反應(yīng)溶液R2。配制一定離子強(qiáng)度的反應(yīng)溶液R1（50mmol／L Tris-HCl緩沖液，pH 7.4），此兩種反應(yīng)溶液共同組成β2-M-LETIA檢測(cè)試劑。

2 結(jié)果

2.1 羧基化PVN納米微球制備條件的考察

2.1.1 緩沖液的影響 總體積為10 m l，NaHCO3和Na2CO3濃度分別為20 mmol／L，通過(guò)取不同體積的溶液配比調(diào)節(jié)緩沖液pH值，制備羧基化PVN納米微球，并測(cè)量反應(yīng)后納米微球的粒徑及粒徑分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHCO3和Na2CO3各5 ml時(shí)，制備出的羧基化PVN納米微球的PDI為0.033，較低；其他配比條件制備出的微球PDI均大于0.1，單分散性較差。

2.1.2 引發(fā)劑濃度的影響 在羧基化PVN納米微球制備過(guò)程中，KPS不僅影響反應(yīng)速度，而且影響納米微球粒徑分布。實(shí)驗(yàn)表明，0.1%的KPS粒徑分布最小為0.038，而KPS濃度為0.3%和0.4%，制備出的羧基化PVN納米微球粒徑和PDI均較大。

2.1.3 VN單體質(zhì)量的影響 在一定范圍內(nèi)，羧基化PVN納米微球的粒徑會(huì)隨著VN單體量的增加而增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)VN單體含量為1 g時(shí)最為合適，單分散性較好。

2.1.4 加入丙烯酸鈉對(duì)粒徑的影響 加入不同質(zhì)量丙烯酸鈉會(huì)對(duì)納米微球的粒徑產(chǎn)生不同的影響，羧基化PVN納米微球的粒徑會(huì)隨丙烯酸鈉量的增加先減小后增大（表1）。

2.1.5 乳化劑濃度的影響 乳化劑SDS對(duì)羧基化PVN納米微球的粒徑有顯著性影響，羧基化PVN納米微球的粒徑隨SDS濃度增加而減小（表2）。通過(guò)掃描電鏡觀察所得羧基化PVN納米微球?yàn)榱骄鶆虻那蛐谓Y(jié)構(gòu)、表面光潔，呈單分散存在（圖1）。

表1 在SDS濃度為0.05%下加入不同質(zhì)量丙烯酸鈉對(duì)納米微球粒徑的影響

表2 乳化劑SDS濃度與羧基化PVN納米微球粒徑關(guān)系

2.2 羧基化PVN納米微球的表征

2.2.1 納米微球的紅外光譜圖 PVN、羧基化PVN、羧基化PVN－IgG的紅外光譜如圖2所示。通過(guò)（圖2A）、（圖2B）比較VN單體、PVN和羧基化PVN微球的紅外吸收峰位發(fā)現(xiàn)，圖2A中1 800 cm－1為烯烴末端－C＝C－H的振動(dòng)譜帶，1 700～2 000cm－1為萘環(huán)及烯烴C＝C的累計(jì)雙鍵振動(dòng)譜帶，1 606 cm－1和1 599cm－1為苯環(huán)骨架振動(dòng)譜帶，指紋區(qū)的771 cm－1和696 cm－1為單取代振動(dòng)譜帶。圖2B在2 920 cm－1和2 848 cm－1為飽和－CH2振動(dòng)譜帶，1 597 cm－1和1 504cm－1為苯環(huán)骨架振動(dòng)譜帶，1 347 cm－1裂為一強(qiáng)一弱兩個(gè)峰，為偕三甲基中碳振動(dòng)譜帶，證明有飽和碳原子，990 cm－1吸收峰消失，證明末端烯烴消失，771 cm－1和696 cm－1指紋區(qū)單取代振動(dòng)譜帶消失，說(shuō)明單體VN合成了聚合物微球。比較圖2B中PVN微球和羧基化PVN微球紅外譜圖可以看出，羧基化PVN微球紅外譜圖在1 573 cm－1處出現(xiàn)－C＝O振動(dòng)譜帶。證明在PVN微球上鍵合了－COOH。圖2C中2 500～3 200 cm－1的寬強(qiáng)峰為－COOH中的締合－OH振動(dòng)譜帶，1 631 cm－1為－C＝O的吸收峰，1 553 cm－1為－N－H的吸收峰，1 037 cm－1為－COOH中的－C－O吸收峰，說(shuō)明IgG成功鍵合在微球表面。

2.2.2 羧基化PVN納米微球以及與羧基化PS納米微球的A對(duì)比 在特定波長(zhǎng)下，同等粒徑的羧基化PVN納米微球比羧基化PS納米微球的A值大，粒徑越大A值相差也越大（表3），說(shuō)明羧基化PVN納米微球的靈敏度更好。

表3 波長(zhǎng)600 nm處羧基化PS與羧基化PVN微球的A值

2.3 β2-M-LETIA試劑的研制及應(yīng)用

2.3.1 制作檢測(cè)試劑因素的考察 經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)每毫升納米微球加入EDC和NHS各0.1 mg和β2-M抗體3 mg時(shí)才能制成β2-M-LETIA試劑。

2.3.2 檢測(cè)接入β2-M抗體數(shù)量 羧基化PS和羧基化PVN微球在接入β2-M抗體后，微球的粒徑和PDI均有所增加。由表2～5可以看出PS微球粒徑120 nm時(shí)接入抗體量較大，120 nm的PVN微球接入量較同粒徑的PS微球大（表4）。

表4 羧基化PS和羧基化PVN接入抗體數(shù)量

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以理論濃度（0、2.5、5.0、10.0、17.5、25.0 mg／L）為橫坐標(biāo)、試劑測(cè)量數(shù)據(jù)A值為縱坐標(biāo)，在0～25 mg／L的濃度范圍內(nèi)，考察以PVN和PS納米微球?yàn)檩d體的β2-M-LETIA試劑的線性范圍并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。如圖所示，自制的羧基化PVN納米微球檢測(cè)試劑的線性范圍較羧基化PS納米微球的線性范圍要好。120 nm羧基化PS納米微球在理論濃度為0～10 mg／L內(nèi)呈線性，在0～5 mg／L范圍內(nèi)其相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.981 5。150 nm羧基化PS納米微球在理論濃度為0～5 mg／L內(nèi)呈線性，其相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.998 8。而120 nm羧基化PVN納米微球在理論濃度為0～17.5 mg／L內(nèi)呈線性，在0～10 mg／L內(nèi)其相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.902 3。因此，PVN納米微球作為L(zhǎng)ETIA試劑的載體材料與PS相比有更高的靈敏度并且可以提供較大的線性范圍。

2.3.4 臨床樣本的方法建立檢測(cè) 用正常人血清和50 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)品配制3個(gè)樣品即S0：正常人血清500μl；S1：正常人血清450μl＋標(biāo)準(zhǔn)品50μl；S2：正常人血清350μl＋標(biāo)準(zhǔn)品150μl。分別將PS納米微球和PVN納米微球檢測(cè)試劑在同一大型生化分析儀上在600 nm處對(duì)臨床樣本中的β2-M進(jìn)行檢測(cè)，并將測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表5。在測(cè)量低值實(shí)際樣品時(shí)，120 nm的PVN納米微球試劑和120、150 nm PS納米微球試劑的回收率處于95%～105%，說(shuō)明測(cè)量準(zhǔn)確；測(cè)量高值實(shí)際樣品時(shí)，由于120 nm PVN納米微球試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍較大，可以得到較高回收率，即測(cè)量結(jié)果較準(zhǔn)確。通過(guò)實(shí)際樣品測(cè)量比較，可知自制以羧基化PVN納米微球?yàn)檩d體的β2-M－LETIA檢測(cè)試劑有明顯優(yōu)勢(shì)。

表5 PVN和PS試劑臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本文研究了pH值、引發(fā)劑和VN單體濃度、乳化劑添加量等各因素在羧基化PVN納米微球的制備過(guò)程中對(duì)其粒徑及粒徑分布的影響：①pH緩沖劑：離子型乳化劑只有在一定的pH值范圍內(nèi)才能起到有效的乳化作用。SDS為陰離子型乳化劑，需要在堿性介質(zhì)中使用，在使用PBS緩沖體系時(shí)微球制備均聚集，后采用NaHCO3-Na2CO3作為緩沖液；②單體：在一定范圍內(nèi)，羧基化PVN納米微球的粒徑會(huì)隨著VN單體量的增加而增加；③乳化劑：乳化劑對(duì)羧基化PVN納米微球的粒徑有顯著的影響，微球粒徑隨乳化劑濃度的增大而減??；④丙烯酸鈉：羧基化PVN納米微球的粒徑會(huì)隨丙烯酸鈉量的增加先減小后增大。由于丙烯酸鈉本身有兩親性，加入量較小時(shí)起乳化劑作用；隨丙烯酸鈉加入量增加，微球粒徑逐漸減小，超過(guò)臨界值，起鹽溶液作用，粒徑隨加入量的增加而增大。通過(guò)對(duì)這些影響因素詳細(xì)地考察，達(dá)到對(duì)羧基化PVN納米微球的粒徑大小和分布進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)一系列的考察可以得知，以1 g VN為單體，SDS為乳化劑，各5m l的20mmol／L的NaHCO3和Na2CO3為緩沖溶液，0.1%KPS為引發(fā)劑，對(duì)得到的羧基化PVN用掃描電鏡、激光粒度儀、傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行表征，表明合成的羧基化PVN微球表面光滑，單分散性好，球形度好，證實(shí)可制備出優(yōu)良的羧基化PVN納米微球。目前，課題組已經(jīng)能夠成功地制備粒徑范圍在60～200 nm的羧基化PVN納米微球。

通過(guò)A值的比較，證明自制的羧基化PVN納米微球的靈敏度要比羧基化PS納米微球高，并通過(guò)與抗體偶聯(lián)制備成β2-M-LETIA試劑應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明PVN納米微球檢測(cè)試劑更靈敏，有更好的線性范圍，在測(cè)量小于17.5 mg／L濃度范圍的樣品時(shí)準(zhǔn)確度更高。PVN納米微球與同粒徑的PS納米微球相比有更高的靈敏度，與大粒徑的PS納米微球相比有較寬的線性范圍。通過(guò)實(shí)際樣品測(cè)量比較可知自制以羧基化PVN納米微球?yàn)檩d體的β2-M-LETIA檢測(cè)試劑具有明顯優(yōu)勢(shì)，PVN納米微球作為L(zhǎng)ETIA試劑的載體材料有很大的臨床應(yīng)用潛力。

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Preparation and app lication of carboxylic polyvinyl naphthalene nanospheres

Zhang Junfeng1，Jin Ying2，Xu Liang3，et al
（1The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211；2The Affiliated Hospital of Armed Police Force Logistics Institute，Tianjin 300163；3Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Developmentof Clinical Therapeutics and Diagnostics，School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

Using vinyl naphthalene（VN）as the monomer，polyvinyl naphthalene（PVN）nanometermicrospheres were synthesized by emulsion polymerization，which were made for immunodetection reagents by carboxylating and coating withβ2-microglobulin（β2-M）antibody.β2-M was determined respectively using polystyrene（PS）and PVN immunodetection reagents and the results were statistically processed and analyzed，the purpose of which was that the performance of PVN-homemade nanoparticles carrier for latex enhanced turbidimetric immunoassay（LETIA）was evaluated.Immunological reagents of carboxylated PVN nanospheres had been successfully used for testing standard samples and having good linearity，therefore they weremore sensitive than that of PS nanospheres.Controllable particle size，monodisperse carboxylated PVN nanoparticles can be successfully synthesized by using method and conditions of this paper and have good prospects for clinical application，which are better than thatof PSnanospheres carrier for LETIA.

vinyl naphthalene；latex enhanced turbidimetric immunoassay；β2-microglobulin；nanospheres

R 318.08；R 313；R 446.11＋2

A

1000－1492（2015）08－1184－05

2015－04－08接收

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：14JCYBJC24300）

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211

2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300163

3天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070

張俊峰，男，碩士，技師；

徐 亮，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xuliang＠tmu.edu.cn；

靳 穎，女，副主任技師，責(zé)任作者，E-mail：jinying9032＠hotmail.com