蔣姍姍，龍 艷，蘇 珂，聶 寒，楊 帆，鄭天鵬，莫如芬

青蒿琥酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB表達(dá)及合成的影響

蔣姍姍，龍 艷，蘇 珂，聶 寒，楊 帆，鄭天鵬，莫如芬

目的探討青蒿琥酯（Art）對(duì)高糖誘導(dǎo)下的大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）表達(dá)及合成的影響。方法體外培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞，分為6組：正常對(duì)照組、高糖組、Art小劑量組、Art中劑量組、Art高劑量組、依那普利組。培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA含量；采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果①與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；②與高糖組比較，Art小、中、高劑量組細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；③與依那普利組比較，Art小、中、高劑量組細(xì)胞TLR4水平表達(dá)均升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與依那普利組比較，Art小、中劑量組細(xì)胞NF-κB水平表達(dá)升高，Art高劑量組細(xì)胞NF-κB水平表達(dá)降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論Art可呈劑量依賴性地抑制高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞TLR4、NF-κB的高表達(dá)及合成。

糖尿病腎?。磺噍镧?；腎小管上皮細(xì)胞；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）本質(zhì)上是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)和促炎癥細(xì)胞因子在DN的發(fā)展中起著決定性作用［1］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一個(gè)主要分布于炎癥細(xì)胞表面的受體超家族，其中TLR4（Toll-like receptor-4，TLR4）主要分布在腎組織，可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）而引起腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素8等前炎癥因子的表達(dá)增加，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［2］，同時(shí)炎癥因子又可進(jìn)一步激活NF-κB，從而誘發(fā)炎癥信號(hào)不斷放大［3］。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國(guó)傳統(tǒng)中藥青蒿素的一種水溶性衍生物，是治療瘧疾的經(jīng)典藥物［4］，研究［5］顯示其對(duì)多種炎癥性病理模型如佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠、哮喘大鼠［6］具有明顯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，已證實(shí)其可減輕腎間質(zhì)炎性損傷［7］，但Art是否對(duì)腎小管上皮細(xì)胞TLR4及NF-κB的表達(dá)存在影響，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)以大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E為模型，觀察高糖及Art對(duì)腎小管細(xì)胞TLR4、NF-κB水平的影響，為Art應(yīng)用于DN防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 NRK-52E購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司（源于ATCC，貨號(hào)CRL-1571）。

1.1.2 主要藥物與試劑 注射用Art（桂林南藥股份有限公司，批號(hào)LA130613）；馬來酸依那普利原料藥（武漢勝天宇生物科技有限公司）；低糖、高糖DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；PCR引物由Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司設(shè)計(jì)合成；WIP組織細(xì)胞裂解液、（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；SDSPAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜（北京索萊寶科技有限公司）；預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo公司）；兔抗鼠TLR4多克隆抗體（美國(guó)Affinity公司）；兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（杭州賢至生物科技有限公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Super ECL Plus超敏發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NRK-52E用含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖濃度5.6 mmol／L）于37℃、5% CO2無菌培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)至80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。取第5～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，同步化24 h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選的藥物濃度，將NRK-52E細(xì)胞分為6組：①正常對(duì)照組：低糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖終濃度5.6 mmol／L）；②高糖組：高糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖終濃度25 mmol／L）；③Art小劑量組：高糖DMEM培養(yǎng)基＋Art（終濃度10 mg／L）；④Art中劑量組：高糖DMEM培養(yǎng)基＋Art（終濃度20 mg／L）；⑤Art高劑量組：高糖DMEM培養(yǎng)基＋Art（終濃度30 mg／L）；⑥依那普利組：高糖DMEM培養(yǎng)基＋依那普利（終濃度5 mg／L）。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)細(xì)胞按上述分組加藥處理48 h后，提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性3 s，退火30 s（各目的引物的引物序列及退火溫度見表1），72℃延伸1 min，循環(huán)31次，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物6 μl，以濃度為1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg／L溴化乙啶）電泳，用SensiAnsys凝膠成像系統(tǒng)攝影并定量分析，計(jì)算名組目的基因與內(nèi)參基因光密度值的比值。

表1 RT-PCR引物序列及反應(yīng)條件

1.4 Western blot法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)細(xì)胞按上述分組加藥處理48 h后，提取各組細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取30 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，95℃水煮變性5 min后，進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠變性電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉2 h，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶200）、GAPDH（1∶1 000），搖床4℃孵育過夜。TBST洗膜后加辣根酶標(biāo)記二抗（1∶5 000），搖床室溫孵育2 h，TBST洗膜后加適量發(fā)光液暗室發(fā)光，曝光后在SensiAnsys凝膠成像系統(tǒng)下拍照并獲取灰度值，以相應(yīng)目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值計(jì)算名組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示。多個(gè)樣本之間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高糖和Art對(duì)NRK-52E細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，各組加藥處理48 h后，正常對(duì)照組細(xì)胞中TLR4、NF-κB mRNA的表達(dá)呈較低水平，高糖組水平明顯升高（P＜0.05）；而Art小、中、高劑量組和依那普利組水平明顯低于高糖組，但仍高于正常對(duì)照組（FTLR4＝273.475、FNF-κB＝80.641，P＜0.01），且Art中、高劑量組較Art小劑量組下調(diào)效應(yīng)更加顯著（P＜0.05）。Art小、中、高劑量組TLR4 mRNA表達(dá)水平較依那普利組升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Art小、中劑量組NF-κB mRNA表達(dá)水平較依那普利組升高，而Art高劑量組的水平較依那普利組降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)（n＝3，±s）

表2 各組細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)（n＝3，±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與高糖組比較：＃P＜0.05；與Art小劑量組比較：△P＜0.05；與Art中劑量組比較：▽P＜0.05

組別TLR4／β-actinNF-κB／β-actin正常對(duì)照0.096±0.0120.075±0.010高糖0.670±0.024*0.870±0.039*Art小劑量0.451±0.013*＃0.684±0.024*＃Art中劑量0.358±0.045*?！?.507±0.060*?！鰽rt高劑量0.183±0.008*?！鳕?.347±0.054*＃△▽依那普利0.166±0.010*?！鳕?.446±0.090*＃△

2.2 高糖和Art對(duì)NRK-52E細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，各組加藥處理48 h后，與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；與高糖組比較，Art小、中、高劑量組和依那普利組細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表達(dá)均降低，但仍高于正常對(duì)照組（FTLR4＝76.482、FNF-κB＝97.262，P＜0.01），且Art中、高劑量組較Art小劑量組下調(diào)效應(yīng)更加顯著（P＜0.05）。Art小、中、高劑量組TLR4蛋白表達(dá)水平較依那普利組升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Art小、中劑量組NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較依那普利組升高，而Art高劑量組的水平較依那普利組降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

表3 各組細(xì)胞TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)（n＝3，±s）

表3 各組細(xì)胞TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)（n＝3，±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與高糖組比較：＃P＜0.05；與Art小劑量組比較：△P＜0.05；與Art中劑量組比較：▽P＜0.05

組別TLR4／GAPDHNF-κB／GAPDH正常對(duì)照0.061±0.0130.026±0.005高糖0.816±0.107*0.636±0.060*Art小劑量0.592±0.053*＃0.408±0.045*＃Art中劑量0.414±0.055*?！?.271±0.024*?！鰽rt高劑量0.230±0.014*＃△▽0.147±0.013*?！鳕屢滥瞧绽?.242±0.013*?！鳕?.193±0.047*?！?/p>

3 討論

DN是一種進(jìn)行性發(fā)展的疾病，高血糖和炎癥反應(yīng)是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素［8］。目前治療DN的藥物很多都是通過抗炎治療的，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）是目前在DN治療中應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)的藥物，有很好的腎臟保護(hù)作用，其可通過多種機(jī)制抑制DN炎癥反應(yīng)，故本研究采用依那普利作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

TLR是參與免疫炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)慢性炎性疾病的重要因素，其中包括糖尿病及其慢性并發(fā)癥。TLR4受體是發(fā)現(xiàn)最早的TLR亞型之一，在腎臟固有細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞能特異性地識(shí)別病原相關(guān)分子模式，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)包括髓樣分化蛋白88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性及非MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化［9］。NF-κB是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通常以p50和p65組成的異源二聚體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，在多種轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與抑制性蛋白質(zhì)IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）結(jié)合，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。IκB蛋白受IκB激酶調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或炎性細(xì)胞因子等信號(hào)刺激時(shí)，IκB激酶逐步被激活，導(dǎo)致IκB蛋白發(fā)生磷酸化、泛素化和降解，而解離后的NF-κB二聚體則轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，結(jié)合特定的DNA序列，并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄［10］。激活的NF-κB能調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附因子的轉(zhuǎn)錄，在免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)等方面起重要作用。國(guó)內(nèi)現(xiàn)已有許多研究表明，TLR4／NF-κB信號(hào)通路在DN的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。研究［11］顯示，DN患者腎組織中TLR4及相關(guān)炎性因子的表達(dá)顯著升高。章超群等［12］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型腎組織中TLR信號(hào)通路蛋白TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65表達(dá)明顯高于正常組。顧俊菲等［13］的體外實(shí)驗(yàn)顯示，高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NF-κB表達(dá)合成較正常糖組顯著增高。本研究結(jié)果也顯示，高糖誘導(dǎo)后大鼠腎小管細(xì)胞中TLR4和NF-κB的表達(dá)均升高，與研究［14］結(jié)果一致。

Art是經(jīng)典的抗瘧藥物，近年來研究［6，15］顯示Art可通過下調(diào)TLR4和NF-κB的表達(dá)來發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用不同濃度Art干預(yù)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞后，TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)水平均較高糖組明顯下降，且Art濃度越高，下調(diào)作用越明顯，呈現(xiàn)出明顯劑量依賴性，從一定程度可說明Art可抑制DN的炎癥反應(yīng)。由于本實(shí)驗(yàn)只觀察了各組細(xì)胞加藥處理后48 h的變化，是否存在時(shí)間依賴性仍需進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)顯示Art高劑量組與依那普利組TLR4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Art中、高劑量組與依那普利組NF-κB水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明適當(dāng)劑量的Art在下調(diào)TLR4／NF-κB炎性信號(hào)通路方面可與ACEI類藥物依那普利達(dá)到同樣的效果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示Art可以降低高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中TLR4和NF-κB表達(dá)，該作用可能與腎臟保護(hù)有關(guān)，但Art作用于TLR4／NF-κB炎性信號(hào)通路的具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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Effects of artesunate on expression and synthesis of Toll-like receptor 4 and nuclear factor-κB in renal tubular epithelial cells induced by high glucose

Jiang Shanshan，Long Yan，Su Ke，et al
（Dept of Endocrinology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo explore the effects of artesunate（Art）on expression and synthesis of Toll-like receptor-4（TLR4）and nuclear factor-κB（NF-κB）in rat renal tubular epithelial cells（NRK-52E）induced by high glucose.MethodsNRK-52E cells were cultured and divided into six groups：normal control group，high glucose group，Art in low dose group，Art in medium dose group，Art in high dose group，and Enalapril group.Cells were collected after 48 hours.The expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels were detected by RTPCR and Western blot.Results①Compared with the normal control group，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in high glucose group gradually increased（P＜0.05）；②Compared with the high glucosegroup，as increases in Art doses，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups gradually reduced（P＜0.05）；③Compared with the Enalapril group，the expressions of TLR4 mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups increased，and the difference between the Art in high dose group and the Enalapril group had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the Enalapril group，the expressions of NF-κB mRNA and protein in the Art in low and medium dose groups increased，but decreased in the Art in high dose group.Furthermore，there was no statistical difference in the Art in medium and high dose groups when compared with the Enalapril group（P＞0.05）.ConclusionArt can suppress the high expression and synthesis of TLR4 and NF-κB of NRK-52E cells induced by high glucose in a dose-dependent manner.

diabetic nephropathy；artesunate；renal tubular epithelial cells；toll-like receptor-4；nuclear factor-κB

R 587.1；R 692.6

A

1000－1492（2015）07－0904－05

2015－03－20接收

廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：S201316-07）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：2012GXNSFAA053085）；廣西高等學(xué)校計(jì)劃科研項(xiàng)目（編號(hào)：201204LX245）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，桂林 541004

蔣姍姍，女，碩士研究生；龍 艷，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ly136988＠163.com