鄧 毅，張 明，張艷萍

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學；3甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

甘肅當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預作用*

鄧 毅1，2，張 明2，張艷萍3

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學；3甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

目的：比較甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏不同產(chǎn)地當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠的干預作用。方法：建立乙酰苯肼溶血性血虛模型，給予當歸水煎液［1.56 g/(kg·d）］22天后，檢測外周血紅細胞（RBC）、血紅蛋白（H G B）、紅細胞壓積（H CT）、白細胞（W BC）、血小板（PLT）、紅細胞膜鈉-鉀-A TP酶（N a+-K+-A TP）和鈣-鎂-A TP酶（Ca2+-M g2+-A TP）活性，并觀察肝臟指數(shù)（LI）、脾臟指數(shù)（SI）、胸腺指數(shù)（TI）的變化。結果：與模型組比較，岷縣當歸能提高RBC、H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），臨夏當歸能提高H G B、H CT降低W BC、PLT（P＜0.05），渭源當歸能提高H G B、H CT降低PLT（P＜0.05），禮縣當歸能降低PLT（P＜0.05）；岷縣當歸能提高N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05），禮縣當歸能提高N a+-K+-A TP酶活性（P＜0.05），臨夏當歸能提高Ca2+-M g2+-A TP酶活性（P＜0.05）；甘肅產(chǎn)各當歸均能降低LI（P＜0.05），有降低SI的趨勢，岷縣、禮縣、渭源當歸能升高TI（P＜0.05）。結論：甘肅當歸［1.56 g/(kg·d）］具有明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象相關指標,提高紅細胞膜A TP活性，降低肝脾指數(shù)，升高胸腺指數(shù)的作用，綜合比較岷縣當歸作用較強。

甘肅當歸；溶血性血虛；外周血象；紅細胞膜A TP酶；器官指數(shù)

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv) Diels.的根，主產(chǎn)于甘肅省東南部的岷縣(秦州)，其性甘溫質(zhì)潤，長于補血，為“補血之圣藥”［1］。甘肅岷縣當歸歷代均被譽為道地藥材，《本草求真》云：“當歸專入心。辛甘溫潤，諸書載為入心生血上品?！惫视卯敋w補心血，心得血養(yǎng)則諸證自除［2］。本實驗考察甘肅不同產(chǎn)區(qū)當歸對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠模型的干預作用，為當歸的補血作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 2013年3月購試驗所用當歸于甘肅岷縣、禮縣、渭源、臨夏及云南，由甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室楊扶德教授鑒定為正品。當歸水煎液的制備：稱取各產(chǎn)地當歸10 g，分別加水80 mL，浸泡30分鐘，煎煮60分鐘，過濾，收集藥液，藥渣中再加入60 mL水煎煮30分鐘，過濾，合并兩次濾液，水浴濃縮至100 mL，含生藥量0.1 g/mL，3～4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。驢膠補血顆粒(九芝堂股份有限公司生產(chǎn)，批號：2012080220)，水溶液制備：取驢膠補血顆粒30 g，加生理鹽水配制成90 mL溶解，含原藥量0.33 g/mL。

1.2 動物 SPF級昆明種小鼠128只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由蘭州大學實驗動物中心提供，動物實驗許可證號：SCXK(甘)2013-0002。

1.3 試劑 肝素鈉(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司生產(chǎn)，批號：F20091231)；乙酰苯肼(天津市光復精細化工研究所生產(chǎn)，批號：20130313)；ATP酶測試盒(批號：20130423)，蛋白質(zhì)快速染色試劑盒(批號：20130503)，考馬斯亮藍G250法，均購于南京建成科技有限公司。

1.4 儀器 Abacus Junior vet5動物血球儀(美國ABBOTT公司提供)；MODEL680酶標儀(美國伯樂公司提供)；Boifuge stratos高速冷凍離心機(美國科俊儀器公司提供)；BS110S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司提供)；XH-B漩渦混勻器(姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司提供)。

1.5 方法

1.5.1 溶血性血虛小鼠模型的復制 參照文獻方法［4-5］，除空白對照組外，其余7組小鼠分別于灌胃第1、4、7、12、17、22天進行皮下注射2%乙酰苯肼(APH)溶液，第一次劑量為200 mg/kg，其余每次劑量為100 mg/kg。

1.5.2 分組與給藥 將128只小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(驢膠補血顆粒組)、岷縣當歸組、禮縣當歸組、渭源當歸組、臨夏當歸組、云南當歸組，每組16只。模型建立后，空白對照組和模型對照組按15.6 mL/kg生理鹽水灌胃；各當歸藥物組給藥劑量根據(jù)成人劑量12 g/70(kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量1.56 g/(kg·d)（含生藥量0.1 g/mL），故各當歸組均按15.6 mL/kg劑量(含生藥量0.1 g/mL)灌胃；陽性對照組給藥劑量根據(jù)成人劑量40 g/70 (kg·d)，依體表面積比例換算得小鼠用藥劑量5.2 g/(kg·d)(含藥量0.33 g/mL)，灌胃劑量為15.6 mL/(kg·d)。以上各組灌胃1次/d，連續(xù)22天。

1.6 檢測指標

1.6.1 外周血象指標的檢測 所有各組于末次給藥24小時后，眼眶取血20 μL，加入已添加肝素鈉的離心管中，用移液槍輕微混勻，采用動物血球儀測定RBC、HGB、HCT、WBC、PLT。

1.6.2 紅細胞膜A TP酶活性的檢測 眼眶取血后，各組小鼠股動脈采血(肝素鈉抗凝)，加4倍生理鹽水，使用冷凍離心機3 000 r/min 4℃離心10分鐘，棄去上清液，在沉淀的紅細胞中加入0.75mL雙蒸水，渦旋30秒，放置15分鐘，再渦旋30秒，再放置15分鐘，使其充分溶血，直至溶質(zhì)透亮［6］。嚴格按ATP酶試劑盒(定磷法)操作說明測定紅細胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.6.3 肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)測定 小鼠取血后處死，取肝臟、脾臟、胸腺稱重，以mg/g單位計算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

肝臟指數(shù)(LI)=肝臟濕重×1 000/體質(zhì)量(單位g)

脾臟指數(shù)(SI)=脾臟濕重×1 000/體質(zhì)量；胸腺指數(shù)(TI)=胸腺濕重×1000/體質(zhì)量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周RBC、H G B、H CT、W BC、PLT檢測結果 模型組的RBC、HGB、HCT和WBC、PLT與空白組比較有顯著下降和上升(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當歸能提高RBC、HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，臨夏當歸能提高HGB、HCT及降低WBC、PLT(P＜0.05)，渭源當歸能提高HGB、HCT及降低PLT(P＜0.05)，禮縣當歸能降低PLT(P＜0.05)。見表1。

2.2 紅細胞膜N a+-K+-A TP酶、Ca2+-M g2+-A TP酶活性檢測結果 模型組的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與空白組比較有顯著下降(P＜0.05)。與模型組比較，岷縣當歸能提高 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)，禮縣當歸能提高Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05)，臨夏當歸能提高Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)。見表2。

2.3 肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)測定 模型組的LI、 SI和TI與空白組比較有顯著上升和下降(P＜0.05)。與模型組比較，甘肅各當歸均能降低LI(P＜0.05)，有降低SI的趨勢，岷縣、禮縣、渭源當歸能升高TI(P＜0.05)。見表3。

表1 對小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

表1 對小鼠RBC、H G B、H CT、W BC、PLT的影響

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與空白組比較，◇◇表示P＜0.01（下同）。

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1）RBC(×1012)/L H G B/(g·L-1) H CT/% W BC(×109)/L PLT×109/L空白對照 16 - 13.48±2.21 377.67±44.02 59.27±9.05 7.08±2.28 838.63±201.07模型對照 16 - 8.29±2.31◇◇276.87±9.05◇◇45.67±12.14◇◇13.57±4.84◇◇1295.43±180.05◇◇陽性對照 16 5.20 9.83±1.14*325.94±15.96**54.38±7.04**7.77±3.78**917.73±280.32**岷縣當歸 16 1.56 10.69±1.65**326.47±34.18**59.69±8.94**9.14±3.53**868.73±204.75**禮縣當歸 16 1.56 9.29±0.82 300.47±17.42 51.59±5.08 12.02±4.16 918.80±159.23**渭源當歸 16 1.56 9.23±1.52 314.00±20.62**55.02±5.47**11.36±3.08 1054.00±211.82**臨夏當歸 16 1.56 9.44±1.35 304.13±24.80*52.30±7.29*9.66±3.39**1079.00±213.81**云南當歸 16 1.56 9.18±1.67 324.64±28.68 51.08±8.60 9.58±3.08 1107.47±242.95

表2 對小鼠紅細胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

表2 對小鼠紅細胞膜N a+-K+-A TP酶 、Ca2+-M g2+-A TP酶的影響(χ±s) μm ol·m gprot-·1hour-1

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） N a+-K+-A TP Ca2+-M g2+-A TP空白對照 16 - 26.86±9.74 43.20±14.53模型對照 16 - 11.64±6.17◇◇14.44±8.69◇◇陽性對照 16 5.20 24.24±10.22**36.84±14.70**岷縣當歸 16 1.56 23.98±8.55**32.74±7.28*禮縣當歸 16 1.56 21.75±5.81*27.17±16.63渭源當歸 16 1.56 18.04±7.86 21.54±15.31臨夏當歸 16 1.56 13.07±8.50 31.94±16.84*云南當歸 16 1.56 18.76±8.64 26.84±13.81

表3 對小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

表3 對小鼠LI、SI、TI的影響(±s)

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） LI/(m g·g-1) SI/(m g·g-1) TI/(m g·g-1)空白對照 16 - 32.92±3.66 2.09±0.49 2.23±0.82模型對照 16 - 48.48±5.39◇◇11.95±2.26◇◇1.48±0.50◇◇陽性對照 16 5.20 41.55±1.98**10.13±2.34*2.18±0.80*岷縣當歸 16 1.56 40.92±2.53**10.74±1.76 2.17±1.16*禮縣當歸 16 1.56 44.76±3.25*11.82±2.32 2.05±0.83*渭源當歸 16 1.56 43.16±3.03**11.11±2.18 2.05±0.62*臨夏當歸 16 1.56 44.21±4.59**11.69±3.45 1.95±0.52云南當歸 16 1.56 46.87±6.96 11.26±2.64 2.09±0.64

3 討論

溶血性貧血(hemolytic anemia)是指紅細胞破壞加速，骨髓造血功能代償不足時發(fā)生的貧血，多見于紅細胞自身異常和紅細胞外部異常兩類。有分析認為血虛與情志、不良飲食、體質(zhì)、疾病、失血、生育、藥毒損傷有關［7］。本實驗采用乙酰苯肼建立溶血性血虛模型，誘導小鼠外周RBC、HGB、 HCT降低，WBC、PLT升高，紅細胞膜Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP活性降低，肝脾腫大，胸腺萎縮。RBC為運送氧氣的主要媒介且具免疫功能；HGB含量的高低代表著血虛的程度；HCT反映紅細胞的濃度；WBC為免疫細胞，具有吞噬異物產(chǎn)生抗體的作用；PLT在止血過程發(fā)揮重要作用［8］。紅細胞膜結構和功能的完整是紅細胞發(fā)揮功能的重要保證，而紅細胞的功能主要是通過膜蛋白來實現(xiàn)的。細胞膜上的Na+-K+-ATP保持膜內(nèi)高鉀，膜外高鈉的平衡，能將ATP分解為ADP并產(chǎn)生能量，對維持紅細胞的形態(tài)和功能具有重要作用，在血虛狀態(tài)下其活力明顯降低［9］；Ca2+-Mg2+-ATP維持細胞外高鈣，細胞內(nèi)高鎂的水平，亦可分解ADP以獲得能量［10］。中醫(yī)認為肝藏血，脾統(tǒng)血為“氣血生化之源”，肝脾的功能失常可以引起血虛。脾臟是人體最大的免疫器官，因此脾臟腫大、胸腺萎縮，將導致機體免疫功能低下，在一定程度會引起機體造血機能的低下，表現(xiàn)為中醫(yī)血虛的病癥［11］。本實驗結果表明，甘肅當歸能明顯改善乙酰苯肼溶血性血虛小鼠外周血象，提高紅細胞膜ATP酶活性，降低肝脾指數(shù)，升高胸腺指數(shù)，對乙酰苯肼溶血性血虛小鼠具有較好的治療作用，綜合比較岷縣當歸作用較強。

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Intervention of Gansu DangGui on the Mice Models with Acetyl Phenyl Hydrazine-induced Hemolytic Blood-deficiency

DENG Yi1,2,ZHANG Ming2,ZHANG Yanping3
1 Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicines of Gansu Province(nurturing station),Lanzhou 730000,China;2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine; 3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective:To compare the intervention of DangGui(Angelica sinensis)of Minxian,Lixian, Weiyuan,Linxia ofGansu province on mice models with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency. Methods:The model with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency was established and given DangGui water decoction[1.56 g/(kg·d)]for 22 days,to detect red blood cells(RBC),hemoglobin(HGB),hematocrit(HCT),white blood cells(WBC),platelet(PLT),the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme in red cell membrane,and observe the changes of liver index (LI),spleen index (SI)and thymus index(TI). Results:Compared with the model group,Minxian Danggui could raise RBC,HGB and HCT but decrease WBC and PLT(P＜0.05),Linxia Danggui could increase HGB and HCT but lower WBC and PLT(P＜0.05),Weiyuan Danggui could increase HGB and HCT,but decrease PLT (P＜0.05),Lixian Danggui could decrease PLT (P＜0.05); Minxian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05),Lixian Danggui could improve the activity of Na+-K+-ATP enzyme(P＜0.05),Linxia Danggui could improve the activity of Ca2+-Mg2+-ATP enzyme(P＜0.05);Gansu Danggui could lower LI(P＜0.05),showing the tendency of decreasing SI, Minxian,Lixian and Weiyuan Danggui could increase TI(P＜0.05).Conclusion:Gansu Danggui[1.56 g/(kg·d)] could improve the related indexes in peripheral blood of mice with acetyl phenyl hydrazine-induced hemolytic blood-deficiency obviously,improve the activity of ATP in red blood cell membrane eividently,decrease liver and spleen indexes and increase TI,and Minxian Danggui shows the strongest function comprehensively.

Gansu DangGui;hemolytic blood-deficiency;peripheral blood;ATP enzyme of red blood cell membrane;organ index

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0005-04

2014-12-27

甘肅省高等學?；究蒲袠I(yè)務費項目(編號2009-4)。

鄧毅(1964—)，男，博士研究生導師，教授。研究方向：中藥及復方藥效基礎的應用研究。