郭鴻雁，冷曉紅，陳海燕，郝彩琴

1寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心

苦豆子籽總生物堿分離純化工藝研究

郭鴻雁1，2，冷曉紅1，2，陳海燕1，2，郝彩琴1，2

1寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏中藥材開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心

目的：選用大孔樹脂純化苦豆子籽提取液的生物堿的純度，提高生物堿的純度。方法：pH=9，濃度為2.0～2.5 m g/m L的料液，抽濾加氯化鈉(1.0 m ol/L)，以樹脂重量與樣品的體積比為1∶3上柱，用3倍樣品體積pH=9的30%乙醇先洗脫，再用3倍樣品體積pH=9為70%乙醇洗脫。結(jié)論：選用非極性D 101大孔樹脂直接從苦豆子籽提取液中分離純化生物終產(chǎn)品總堿純度可達(dá)60%以上，洗脫率為97%以上，分離效果好。

苦豆子籽；大孔樹脂；分離純化

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)為豆科植物的干燥全草及種子。產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、新疆等地。由于其較高的藥用價(jià)值和生態(tài)功能，苦豆子資源的合理保護(hù)與開發(fā)利用越來越引起人們的重視，寧夏回族自治區(qū)已將苦豆子列入重點(diǎn)保護(hù)的六大道地藥材之一，納入國家中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃中，生產(chǎn)基地建設(shè)和深層次開發(fā)都有長足的發(fā)展?？喽棺游稑O苦、性寒有毒，具有清熱解毒，抗菌消炎、止痛殺蟲等作用。目前苦豆子籽的分離純化方法常采用溶劑提取、離子樹脂交換法。溶劑提取不利點(diǎn)是因使用有機(jī)溶劑多為甲苯、氯仿、甲醇，對環(huán)境、人體存在一定危害并殘存于提取物中；離子樹脂交換法一般是利用陽離子樹脂的酸根與生物堿的胺基基團(tuán)作用，將生物堿富集在樹脂上，再用堿液將生物堿解離，得到游離的生物堿，缺點(diǎn)是生物堿與樹脂的結(jié)合力強(qiáng)，不能將生物堿完全洗出，所以主要生物堿的損失較大，本實(shí)驗(yàn)選用大孔樹脂與離子樹脂不同的是不交換基團(tuán)，它主要是依靠物質(zhì)間范德華力、偶極力和氫鍵力來進(jìn)行物質(zhì)間的分離。本實(shí)驗(yàn)大孔吸附樹脂對苦豆子籽中的生物堿進(jìn)行分離，先通過靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)選出最佳樹脂；然后通過動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察上柱量、上柱液pH等因素對吸附率的影響，確定最佳上柱條件；找出最佳的洗脫條件。常用的洗脫劑有：甲醇、乙醇、四氯化碳、丙酮、水等，為減少產(chǎn)品的有害溶劑殘留及降低環(huán)境污染，本實(shí)驗(yàn)選用乙醇與水。

本實(shí)驗(yàn)選用非極性D101大孔樹脂直接從苦豆子籽提取液中分離純化生物終產(chǎn)品總堿純度可達(dá)60%以上，洗脫率在97%以上，分離效果好，該法的優(yōu)點(diǎn)是生物堿吸附速度快，洗脫容易，樹脂的壽命長，為其產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)保障，使其易于生產(chǎn)，創(chuàng)造更大的社會效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 苦豆子提取液，實(shí)驗(yàn)室制備；溴麝香草酚藍(lán)，分析純，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供；乙醇，分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；鹽酸，分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；氫氧化鈉分析純，天津試劑有限公司一分廠生產(chǎn)；pH試紙，上海黃海試劑廠生產(chǎn)；D101樹脂(實(shí)驗(yàn)級)、AB-8樹脂(實(shí)驗(yàn)級)，上海天蓮樹脂有限公司生產(chǎn)；中極性樹脂BS-30(實(shí)驗(yàn)級)、弱極性樹脂BS-67-2(實(shí)驗(yàn)級)、非極性樹脂BS-67-3(實(shí)驗(yàn)級)，蚌埠市遼源生物科技有限公司生產(chǎn)；槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿，由中國食品藥品生物鑒定所提供；碘化鉍鉀，分析純，天津雙雙試劑有限公司提供。

1.2 儀器 BT-101電子蠕動(dòng)泵(上海信宜儀器有限公司生產(chǎn))，RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城儀器有限公司生產(chǎn))，XS105DU電子天平(梅特勒生產(chǎn))，TU-1810紫外可見分光計(jì)(北京普析色譜儀器有限公司生產(chǎn))，1220高效液相色譜儀(美國安捷倫公司生產(chǎn))，Φ2 cm×50 cm、 Φ150cm×1 000 cm層析柱(定制)，HG90708恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn))，LD-S-10［1］低速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 將20 g樹脂使用95%的乙醇溶液浸泡24小時(shí)，保證樹脂充分溶脹，濕法裝柱，柱高60 cm，直徑15 cm，用乙醇95%溶液淋洗至洗脫液與水混合(1∶2)不成白色混濁為止，再用純化水洗至無醇味，2%的鹽酸溶液浸泡3小時(shí)，水洗至中性流數(shù)為4～6 BV/h，5%氫氧化鈉溶液浸泡3小時(shí)，水洗至中性流數(shù)為4～6 BV/h，備用。

1.3.2 大孔樹脂篩選 對弱極性、非極性、中極性樹脂進(jìn)行比較篩選。取苦豆子籽濃縮提取液適量2%NaOH調(diào)pH至9，離心、過濾備用。將經(jīng)過預(yù)處理過的樹脂，加入濃縮樣波美度5(下總堿都是以五總堿計(jì)，5種堿為氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參堿、槐果堿)供試液70mL，濃度2.20mg/mL，上樣總堿量154 mg，靜止24小時(shí)，使之充分吸附，取流出液用液相測定總堿，6倍上樣體積70%乙醇洗脫柱6次，使用洗脫劑共計(jì)300 mL，收集洗脫液測總堿。見表1。

表1 大孔樹脂篩選

吸附率=(吸附前上樣總堿量-吸附后續(xù)濾液總堿量)/吸附前上樣總堿量×100%

洗脫率=洗脫出總堿量/吸附總堿量×100%得出非極性樹脂吸附與洗脫性能良好。

1.3.3 非極性樹脂篩選 經(jīng)過預(yù)處理過非極性樹脂D101、AB-8、BS-67-3加入供試液上樣供試液70 mL，濃度2.20 mg/mL，上樣總堿量154 mg使之充分吸附，取續(xù)濾液用液相測定總生物堿，6倍上樣體積70%乙醇洗脫柱6次，使用洗脫劑共計(jì)300mL，收集洗脫液測總堿。得出D101樹脂吸附與洗脫性能良好。見表2。

表2 非極性樹脂篩選

1.4 吸附液pH考察 處理D101樹脂柱10根(2cm×50cm)，樹脂量為20g，樣品濃度為2.29mg/mL (液相測得)，分別用2%鹽酸與5%氫氧化鈉調(diào)節(jié)不同數(shù)值pH上樣，用改良碘化鉍鉀試液噴在濾紙上，檢測流出液中是否有生物堿，如果濾紙?jiān)嚰堊兩?，則有生物堿流出，無變色繼續(xù)上樣，直至變色為止。得出pH4、pH9、pH10吸附總堿量高，樹脂的耐受范圍pH4～10，取pH9上樣。見表3。

表3 吸附液pH考察

1.5 不同乙醇洗脫液濃度的考察 配制不同濃度的乙醇作為洗脫液，洗脫以上3.4吸附柱，6倍上樣體積不同濃度乙醇洗脫柱6次，收集洗脫液，用液相測總堿。得出洗脫乙醇濃度在30%～70%之間洗脫生物堿量高，極性強(qiáng)的生物堿在低濃度洗脫量高，非極性生物堿在高濃度洗脫量高。見表4。

表4 不同乙醇洗脫液濃度的考察

1.6 樣品中加氯化鈉對吸附量的考察 生物堿在吸附過程中加入氯化鈉，因鹽析的作用降低生物堿的溶解趨勢，顯著增加吸附速度及吸附容量，從而與其他成分分離，提高樹脂的分離純化提取率，但氯化鈉的量的加入有一定的范圍，通過上樣樣品中(濃度2.20 mg/mL液相測得)加入不同濃度的氯化鈉，再加入樹脂柱中，用改良碘化鉍鉀試液噴在濾紙上，檢測流出液中是否有生物堿，如果濾紙?jiān)嚰堊兩瑒t有生物堿流出，無變色繼續(xù)上樣，直至變色為止。見表5。

表5 樣品中加氯化鈉對吸附量的考察

顯然，隨著NaCl濃度的增大吸附量也隨著增大，然而NaCl濃度大于1 mol/L以后，增加NaCl濃度，樹脂對生物堿吸附的量無增加，并且濃度越大將來對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕越強(qiáng)，因此上柱液的鹽離子濃度定為1 mol/L。因該大孔樹脂對Na+，Cl-均不吸附，故添加NaCl對于生物堿純度及活性并無影響。

1.7 不同PH 70%乙醇洗脫劑洗脫率考察 使用3.6吸附樣品的樹脂柱進(jìn)行不同pH70%乙醇洗脫劑實(shí)驗(yàn)，6倍上樣體積不同pH70%乙醇洗脫柱6次，收集洗脫液，液相測總堿。見表6。

表6 不同pH 70%乙醇洗脫劑洗脫率考察

pH是9，70%的洗脫率最高。

1.8 不同梯度濃度洗脫液的考察 樣品加濃度為1.0 mol/L的氯化鈉，濃度為2.20mg/mL(液相測得)上柱，pH為9，每個(gè)柱子上樣70mL，總堿154mg，進(jìn)行不同梯度pH9乙醇的洗脫劑洗脫，收集不濃度的洗脫液用液相測總堿，再計(jì)算不同梯度組總堿量。數(shù)據(jù)觀察得出第一組的洗脫總堿量高，但從生產(chǎn)工藝簡單角度考慮，工業(yè)蒸發(fā)回收的乙醇-水即可達(dá)到70%～30%的濃度，使之可以循環(huán)利用，既節(jié)約資源又提高效益，故以30%～70%洗脫梯度為最佳。見表7。

表7 不同梯度濃度洗脫液的考察

1.9 樹脂連續(xù)上樣次數(shù)的考察 樣品加氯化鈉1.0 mol/L，濃度為2.20 mg/mL(液相測得)上柱，pH為9，每次柱子上樣70 mL，154 mg，連續(xù)上10次樣，洗脫液pH值為9，用30%～70%乙醇分別用(3倍上樣量)210 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液用液相測總堿量。從樹脂上樣次數(shù)分析，樹脂可以連續(xù)上樣，最少可以連續(xù)10次，直至吸附量降到90%，進(jìn)行樹脂再生。見表8。

表8 樹脂連續(xù)上樣次數(shù)的考察

1.10 中試放大200倍 分別處理樹脂3 kg，裝入150 cm×1 000 cm層析柱中，分別上超聲乙醇提取濃縮液，經(jīng)過加5%氫氧化鈉pH至9，離心過濾料液10 L，液相測總堿濃度為2.47 mg/mL，用pH9，30%～70%乙醇洗脫劑，梯度洗脫，蠕動(dòng)泵收集洗脫液，洗脫液收集后用液相測總堿，再將洗脫液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得膏狀產(chǎn)品。膏狀產(chǎn)品，分別用液相(溴麝香草酚藍(lán)比色法)測總堿，減重法測水分。見表9。

表9 中試放大200倍

1.11 樹脂再生的考察 95%乙醇洗脫至無色，再用2%鹽酸浸泡3小時(shí)，用水洗至中性，再用2%氫氧化鈉浸泡3小時(shí)，用水洗至中性，吸附效果同新處理樹脂。

2 結(jié)果

pH值為9，且濃度為2.0～2.5 mg/mL(5種堿計(jì))的料液，抽濾加氯化鈉(1.0 mol/L)，以樹脂重量與樣品的體積比為1∶3上柱，用3倍樣品體積30%乙醇(pH=9)先洗脫，再用3倍樣品體積70%乙醇(pH=9)洗脫。按此條件純化，苦豆堿提取率在97%以上，終產(chǎn)品總生物堿純度可達(dá)60%以上。

3 討論

有機(jī)溶劑提取分離技術(shù)是天然產(chǎn)物分離的經(jīng)典技術(shù)，由于苦豆子生物堿特別是生物堿的氮氧化物水溶性較大，很難萃取完全，加上界面時(shí)有乳化等因素導(dǎo)致萃取效率較低，生物堿的得率低，尤其是常使用有機(jī)溶媒為氯仿、甲醇、甲苯對設(shè)備要求高，而且對操作者、環(huán)境有一定危害，產(chǎn)品殘存有劑溶媒，一般僅適用于實(shí)驗(yàn)室小量樣品的制備，而不宜用于工業(yè)生產(chǎn)［1-3］。

離子交換法用離子交換樹脂提取恰好可解決萃取的這些問題，有機(jī)溶媒用量少，但本實(shí)驗(yàn)中的苦參類生物堿與離子交換樹脂鍵合力太強(qiáng)［4-8］，用大量的堿性(pH9)乙醇-(70B30)長時(shí)間洗脫，生物堿也不能完全洗出，樹脂的再生利用也困難，主要生物堿的損失較大，生物堿的得率也低。

大孔樹脂具有的吸附能力強(qiáng)，預(yù)處理簡單，容易洗脫，機(jī)械強(qiáng)度大，容易再生，使用壽命長，液體流動(dòng)阻力低，抗有機(jī)污染能力強(qiáng)，規(guī)模放大效應(yīng)好等優(yōu)點(diǎn)。使用的NaOH、HCl和NaCl價(jià)廉易得，所產(chǎn)生的廢水既易于中和排放，其中使用的乙醇可收循環(huán)利用，尤其選用的D101大孔樹脂對生物堿吸附速度快、吸附量大，且洗脫既快又徹底，生產(chǎn)周期短，符合當(dāng)前的清潔生產(chǎn)，綠色環(huán)保生產(chǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)方式，是當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)趨勢。

［1］ 崔九成，佟姝麗.氧化苦參堿的提取分離工藝研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，23(5):51-52.

［2］ 秦學(xué)功，元英進(jìn).高效薄層色譜分離苦豆子生物堿的體系優(yōu)化［J］.中草藥，2002，33(6):513.

［3］ 孔令明.苦參總堿提取及其中苦參堿、氧化苦參堿分離、純化的研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［4］ 郭安.苦參總堿和氧化苦參堿提取純化工藝［D］.昆明：西南林學(xué)院，2005.

［5］ 仝燕，王錦玉，張鍇鑌，等.苦參堿提取純化工藝研究［J］.中國方劑學(xué)雜志，2007，13(1)：19-22.

［6］ 李永春.苦豆子生物堿提取與分離純化技術(shù)研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［7］ 秦學(xué)功，元英進(jìn).用大孔樹脂吸附吸附分離苦豆子生物堿［J］.中國中藥雜志2007，27(6):428-429.

［8］ 秦學(xué)功.苦豆子生物堿分離純化與生物活性研究［D］.天津:天津大學(xué)，2002.

Study on the Separation and Purification of Total Alkaloids from the Seeds of KuDouZi

GUO Hongyan1,2,LENG Xiaohong1,2,CHEN Haiyan1,2,HAO Caiqin1,2
1 Ningxia Polytechnic,Yinchuan 750021,China;
2 Ningxia Engineering Research Center of Chinese Medicine Development and Utilization

Objective:To increase the purity of alkaloids by applying macroporous resin to total alkaloids from the extract of KuDouZi(Sophora alopecuroides L)seeds.Methods:Feed liquid,scaling pH=9,in the concentrations of 2.0 and 2.5 mg/mL,leaching and adding sodium chloride (1.0 mol/L),the weight of macroporous resin and the volume of the samples were in the ratio of 1:3 on the column,three times of the volume of the samples,pH=9,were used to elute firstly,and then three times volume of 70%ethanol with pH=9 were used.Conclusion:Non-polar D101 macroporous resin is chosen to separate and purify total alkaloids of the extract of KuDouZi seeds directly,which could make the purity of total alkaloids more than 60%,elution rate higher than 97%and obtaining good separation effects.

the seeds of KuDouZi;macroporous resin;separation and purification

R284.2

A

1004-6852(2015)10-0049-04

2014-12-08

郭鴻雁(1967—)，女，高級工程師。研究方向：生物制藥。