楊 簡，范致星，李馨欣，彭家芹，姜玉蓉，陳 勇

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，湖北宜昌 443003)

·論著·

高遷移率蛋白B1對血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響及分子機(jī)制研究*

楊 簡，范致星，李馨欣，彭家芹，姜玉蓉，陳 勇

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心內(nèi)科，湖北宜昌 443003)

目的 探討高遷移率蛋白B1(HMGB1)對血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移的影響及TLR4依賴的TLR4/PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)的分子機(jī)制。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，采用不同濃度HMGB1(0.1～1 000.0 ng /mL)處理，分為對照組(未經(jīng)任何處理)、HMGB1組、HMGB1+TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染組、Control siRNA轉(zhuǎn)染組和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(LY294002)干預(yù)組，觀察各組細(xì)胞活性及HMGB1對VSMCs遷移的影響；實時定量RT-PCR與Western blot分別檢測TLR4、Akt、p-Akt、PI3K mRNA和蛋白的表達(dá)；ELISA測定PI3K的活性。結(jié)果 HMGB1(0.1～1 000.0 ng/mL)呈劑量依賴性促進(jìn)VSMCs遷移(P<0.05)；經(jīng)細(xì)胞活性測定，HMGB1在使用的濃度范圍內(nèi)對VSMCs未造成細(xì)胞毒性作用(P<0.05)；HMGB1(100 ng/mL)處理的VSMCs細(xì)胞組PI3K活性及Akt磷酸化水平明顯增加(P<0.05)；經(jīng)TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，HMGB1引起的VSMCs 遷移明顯減弱(P<0.05)，同樣在PI3k抑制劑干預(yù)組，PI3K/Akt途徑活化和HMGB1介導(dǎo)的VSMCs 遷移也被明顯抑制(P<0.05)。結(jié)論 HMGB1呈劑量依賴性促進(jìn)VSMCs遷移，TLR4依賴的TLR4/PI3K/Akt信號通路參與了此過程，提示以TLR4依賴的PI3K/Akt途徑為靶點，可為阻塞性血管疾病的治療提供新思路。

Toll樣受體4；高遷移率蛋白B1；PI3K/Akt信號通路；血管平滑肌細(xì)胞

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的遷移是動脈粥樣硬化和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后血管再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，其受多種生物學(xué)信號的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子、生長因子、血管活性肽等，其中促炎介質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。高遷移率蛋白B1(HMGB1)是一種有效的促炎因子，參與了多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。在既往的研究中，HMGB1被認(rèn)為是一個作用于VSMCs等不同細(xì)胞系的化學(xué)誘導(dǎo)物[4]，其主要與RAGE結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞的遷移[5]。TLR4作為HMGB1的另一個受體，廣泛表達(dá)于脈管系統(tǒng)，可通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路(如MAPK、JNK、NF-κB)誘導(dǎo)免疫和炎性反應(yīng)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB信號通路能誘導(dǎo)HMGB1介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活[7]，而且有研究發(fā)現(xiàn)球囊損傷后的VSMCs TLR4表達(dá)明顯增加[8]，這說明TLR4依賴的信號通路也可能參與了HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。磷脂酰肌醇3-激酶類(PI3Ks)和其下游的絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt (PI3K/Akt)在調(diào)控VSMCs的遷移、增殖、分化中扮演重要角色[9]。PI3K/Akt通路通過其配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合而激活，有研究發(fā)現(xiàn)TLR4與PI3K/Akt通路存在著交互效應(yīng)[10]。基于上述發(fā)現(xiàn)，本實驗將探討TLR4依賴的PI3K/Akt信號通路是否參與了HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 重組人HMGB1購自Sigma公司，PI3K抑制劑(LY294002) 購自Calbiochem公司；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；磷酸化Akt(Ser-473)抗體、Akt抗體購自Cell Signaling 公司；TLR4 siRNA、Control siRNA、TLR4抗體、PI3K抗體、GAPDH 抗體均購自Santa Cruz生物公司。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 從雄性SD大鼠(100～150 g)胸主動脈中分離出原始VSMCs，用含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將培養(yǎng)的第3～10代VSMCs用于實驗研究。根據(jù)VSMCs生物形態(tài)特性及生長規(guī)律，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，用特異性平滑肌細(xì)胞抗體SM-α-Actin，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

1.3 細(xì)胞活性測定 細(xì)胞活性測定用于評估HMGB1對于VSMCs的細(xì)胞毒性：0.4%臺盼藍(lán)染液處理經(jīng)不同濃度HMGB1(0.1～1 000.0 ng/mL)刺激培養(yǎng)的VSMCs，染色5 min后于光鏡下觀察。細(xì)胞活性即未染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。

1.4 細(xì)胞遷移實驗 使用直徑6.5 mm的聚碳酸脂膜transwell小室進(jìn)行VSMCs遷移實驗：將經(jīng)胰酶消化的細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于transwell小室的上室，在其下室中加入含有不同濃度HMGB1(0.1～1 000.0 ng/mL)的無血清DMEM培養(yǎng)基。然后將制備好的transwell小室置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，取出濾膜，去除上層VSMCs，用甲醇固定，蘇木素染色。光鏡下觀察遷移到濾膜下室面的VSMCs并計數(shù)，每個樣本計數(shù)4個隨機(jī)選擇的高倍視野(×200)的細(xì)胞數(shù)。

1.5 siRNA 轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)的VSMCs達(dá)到60%～70%的融合后，根據(jù)生物公司提供的操作說明，運用Lipofectamine 2000將等量的TLR4 siRNA或Control siRNA(作為陰性對照)分別轉(zhuǎn)染VSMCs，48 h后收集細(xì)胞用實時定量RT-PCR與Western blot檢測TLR4的沉默效果。

1.6 RT-PCR檢測基因的表達(dá)水平 采用TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。本實驗設(shè)定GAPDH為管家基因，設(shè)計PCR擴(kuò)增的引物序列(TLR4：正向引物5′-AGC CAT TGC TGC CAA CAT CA-3′，反向引物5′-GCC AGA GCT ACT CAG AAA C-3′；GAPDH：正向引物5′-GAC AAC TTT GGC TCG TGG A-3′，反向引物5′-ATG CAG GGG TTC TGG-3′)。實時熒光定量PCR由ABI Prism7500序列檢測系統(tǒng)完成，定量結(jié)果使用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。

1.7 Western blot檢測蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌兩次后，于裂解緩沖液中采集。離心后蛋白樣品經(jīng)10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在室溫條件下用5%脫脂奶粉及Tris-緩沖鹽溶液封閉后，分別加入TLR4抗體、磷酸Akt (Ser-473)抗體、Akt抗體、GAPDH 抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育。蛋白檢測由ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒完成。

1.8 PI3K 的活性測定 HMGB1(100 ng/mL)處理TLR4 siRNA和Control siRNA 轉(zhuǎn)染的VSMCs 6 h后，對獲得的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀和PI3K活性測定[11]。每個樣本取500 μg，加入PI3K p85抗體處理4 ℃過夜，析出的免疫復(fù)合物經(jīng)蛋白A瓊脂糖小體于4 ℃處理2 h。然后，離心收集樣本，激酶緩沖液洗滌。PI3K的活性由競爭性ELISA試劑盒測定。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1對VSMCs遷移的影響 培養(yǎng)的大鼠胸主動脈VSMCs在顯微鏡下呈典型的“峰谷”樣生長。經(jīng)特異性平滑肌細(xì)胞抗體SM-a-Actin免疫染色后證實，本實驗細(xì)胞純度大約為90%。經(jīng)不同濃度HMGB1處理VSMCs可以顯著增加其遷移活性，且HMGB1濃度為100 ng/mL時，細(xì)胞遷移效應(yīng)最大。經(jīng)細(xì)胞活性測定，HMGB1在使用的濃度范圍內(nèi)并未對VSMCs造成細(xì)胞毒性作用。

A：TLR4 mRNA分析圖；B：Western blot圖；C:Western blot圖分析圖；a:P<0.05。

圖1 各組細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)情況

A：對照組；B：HMGB1組；C：HMGB1+Control siRNA組；D:HMGB1+TLR4 siRNA組；E:VSMCs細(xì)胞相對遷移分析圖；a:P<0.05。

圖2 TLR4在HMGB1介導(dǎo)VSMCs遷移中的作用

2.2 TLR4在HMGB1介導(dǎo)VSMCs遷移中的作用 為確定TLR4是否參與了HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移，用100 ng/mL HMGB1 處理經(jīng)TLR4 siRNA 轉(zhuǎn)染后的VSMCs。結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染48 h后，與Control siRNA組比較，TLR4 siRNA組TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低，分別下降(67.5±5.7)%和(78.3±3.2)%(P<0.05)。此外，HMGB1刺激TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染的VSMCs，遷移也受到明顯抑制，見圖2。

2.3 PI3K/Akt信號通路在HMGB1介導(dǎo)VSMCs遷移中的作用 與對照組比較，經(jīng)HMGB1(100 ng/mL)處理的VSMCs可以顯著增加PI3K活性和Akt(Ser-473)磷酸化水平(P<0.05)。然而，TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染VSMCs后再用相同劑量HMGB1刺激，PI3K活性和Akt (Ser-473)磷酸化水平被明顯抑制(P<0.05)，見圖3。這些數(shù)據(jù)表明，HMGB1可能通過TLR4激活PI3K/Akt途徑介導(dǎo)VSMCs的遷移。

2.4 PI3k在HMGB1介導(dǎo)Akt 激活和VSMCs遷移中的作用 上述結(jié)果已經(jīng)證實PI3K與VSMCs的遷移有關(guān)，為確定PI3k是否參與了HMGB1介導(dǎo)的Akt激活和VSMCs遷移。本研究采用PI3K抑制劑LY 294002(10 μM)預(yù)處理VSMCs 30 min后，再用HMGB1刺激，結(jié)果如圖4，LY 294002預(yù)處理能明顯減少HMGB1介導(dǎo)的Akt磷酸化水平(P<0.05)，但對其總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑LY 294002能明顯抑制HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移(P<0.05)，見圖5。這些結(jié)果表明，PI3K在HMGB1介導(dǎo)的Akt活化和VSMCs遷移中起著十分重要的作用。

A：PI3K的活性測定；B：總Akt及磷酸化Akt(Ser-473)的表達(dá)水平；a：P<0.05。

圖3 HMGB1通過 TLR4激活PI3K/Akt途徑介導(dǎo)VSMCs遷移

a：P<0.05。

圖4 Western blot 檢測p-Akt和Akt蛋白表達(dá)情況

A：對照組；B：HMGB1組；C：HMGB1+PI3K抑制劑組；D：VSMCs相對遷移率分析圖；a:P<0.05。

圖5 LY294002抑制HMGB1介導(dǎo)的Akt磷酸化和VSMCs遷移

3 討論

近年來，有研究報道HMGB1主要通過結(jié)合其受體RAGE或者激活TLR4/NF-κB通路產(chǎn)生炎性反應(yīng)來促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移[5,7]。但是，抗炎因子或NF-κB與RAGE的抑制劑均不能完全抑制HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移，說明還存在其他的信號介質(zhì)參與了HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。因此，關(guān)于HMGB1介導(dǎo)VSMCs遷移的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需深入探究。PI3K/Akt是常見的細(xì)胞信號通路，在細(xì)胞遷移、增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用[9]。PI3K是Akt良好的活化劑，有活性的Akt(p-Akt)與VSMCs 的遷移有關(guān)[12]，也有人發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt與TLR4通路下游的激活有關(guān)[13]。因此作者提出假設(shè)：PI3K/Akt通路是否通過TLR4參與HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。本研究證實HMGB1在體外呈劑量依賴性的促進(jìn)VSMCs遷移，在此過程中，TLR4 siRNA可以抑制HMGB1 誘導(dǎo)的VSMCs遷移，這說明TLR4參與了這一過程。TLR4 siRNA還能明顯抑制HMGB1誘導(dǎo)的PI3K活性和Akt磷酸化。同時PI3K的抑制劑LY294002也能有效抑制Akt 的磷酸化和HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。這些結(jié)果提示TLR4/PI3K/Akt 途徑在HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移中扮演重要角色。

本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是TLR4沉默還是PI3K的抑制劑LY294002 仍然不能完全抑制Akt磷酸化和HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。由此，推測HMGB1介導(dǎo)VSMCs遷移的調(diào)控機(jī)制可能還涉及其他受體，例如TLR2或細(xì)胞內(nèi)其他信號途徑的參與，這需要進(jìn)一步實驗研究來闡明這一復(fù)雜機(jī)制。

總之，本研究結(jié)果說明TLR4/PI3K/Akt信號通路參與了HMGB1介導(dǎo)的VSMCs遷移。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于更好地理解HMGB1介導(dǎo)VSMCs 遷移的分子機(jī)制，也提示以TLR4 依賴的PI3K/Akt途徑為靶點，可為狹窄阻塞性血管疾病的治療提供新思路。

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Effect of HMGB1 on the migration of vascular smooth muscle cells and its molecular mechanism*

YangJian,FanZhixing,LiXinxin,PengJiaqin,JiangYurong,ChenYong

(DepartmentofCardiology,theFirstClinicalMedicalCollege,TheThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Objective To investigate the effect of high mobility group box-1(HMGB1) on the migration of vascular smooth cells(VSMCs) and the role of TLR4-dependent PI3K/Akt pathway in the process.Methods Primary VSMCs were isolated from the thoracic aorta of male SD rats and cultured in vitro.Control group,TLR4 siRNA transfected group,control siRNA transfected group and PI3k inhibitor (LY294002) intervention group were stimulated by HMGB1 (0.1-1 000.0 ng/mL).Expression of TLR4 mRNA was detected by RT-PCR,protein expression of TLR4,Akt,pAkt,PI3K were detected by Western blot.Activity of the immunoprecipitated PI3K enzyme was assessed in a competitive ELISA.The migration and cell viability of every groups were observed.Results HMGB1 (0.1-1 000.0 ng/mL) stimulated VSMCs migration in a dose-dependent manner and incubation of VSMCs with 100 ng/mL caused a rapid migration (P<0.05).At the concentrations used,HMGB1 did not cause any cytotoxic effects (P<0.05).Migration of VSMCs toward HMGB1 was significantly inhibited by silencing of TLR4 (P<0.05).Pretreated cells with TLR4 siRNA or the PI3K inhibitor LY294002 could markedly block PI3K/Akt pathway activation and VSMCs migration mediated by HMGB1 (bothP<0.05).Conclusion HMGB1 stimulated VSMCs migration in a dose-dependent manner and TLR4-dependent PI3K/Akt signaling pathway played an important role in the migration of VSMCs mediated by HMGB1.This research indicates that TLR4-dependent TLR4/PI3K/Akt signaling pathway could be the target in the treatment of obstructive cardiovascular disease.

Toll-like receptor 4;high mobility group box-1;PI3K/Akt pathway;vascular smooth muscle cells

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.04.003

國家自然科學(xué)基金資助項目(81200088)；宜昌市科技研究與開發(fā)項目(A12301-01)。 作者簡介：楊簡(1982-)，碩士，主要從事冠心病基礎(chǔ)與臨床研究。

R54

A

1671-8348(2015)04-0439-03

2014-08-10

2014-10-10)