韓巖智，劉 浩，阮開學(xué)

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 832008)

·論著·

幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織細(xì)胞因子變化的實(shí)驗(yàn)研究*

韓巖智，劉 浩，阮開學(xué)

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 832008)

目的 研究幽門螺旋桿菌(簡(jiǎn)稱幽門螺桿菌)感染小鼠胃黏膜組織細(xì)胞因子變化,初步探討幽門螺桿菌感染的免疫機(jī)制。方法 選取8～10周齡BALB/c小鼠24只，雌雄各半，分為觀察組和對(duì)照組，兩組造模前均禁食12 h，觀察組以2×109CFU/mL濃度的幽門螺桿菌菌液 0.5 mL/d灌胃，連續(xù)7 d。對(duì)照組灌胃給生理鹽水，0.5 mL/d，連續(xù)7 d，進(jìn)行幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜造模。采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)檢測(cè)感染2、4周后，小鼠血漿中γ干擾素(IFN-γ)、重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)以及IL-10 mRNA的表達(dá)量，并于感染4周后，處死小鼠，無(wú)菌取各組小鼠的胃組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法檢測(cè)胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8及IL-10蛋白的水平。結(jié)果 兩組小鼠感染2周后，觀察組IL-8高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。感染4周后，IFN-γ、TNF-α、IL-8的mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯上升，但觀察組上升幅度明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 TH2細(xì)胞在幽門螺桿菌感染中的作用表現(xiàn)不明顯，能促進(jìn)TH1型細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)，引發(fā)TH1為主的免疫反應(yīng)。

螺桿菌，幽門；胃黏膜；細(xì)胞因子類；感染

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌(下文簡(jiǎn)寫為幽門螺桿菌)與胃潰瘍、胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。細(xì)胞因子是指主要由免疫細(xì)胞分泌的、能調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽，他們有調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的生理功能，在胃腸道黏膜免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[3-4]。本研究采用8～10周齡BALB/c小鼠12只，灌胃給幽門螺桿菌菌液，連續(xù)7 d，進(jìn)行造模。之后采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)感染2、4周后各小鼠部分細(xì)胞因子mRNA的變化及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法檢測(cè)感染4周后小鼠胃黏膜組織中部分細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)量。本文初步探討了幽門螺桿菌感染的免疫機(jī)理，旨在為幽門螺桿菌的預(yù)防及治療提供部分理論依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8～10周齡BALB/c小鼠24只，雌雄各12只，體質(zhì)量18～22 g。分為觀察組和對(duì)照組，每組12只。各組小鼠在周齡、體質(zhì)量、性別構(gòu)成比以及灌胃給藥操作等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說(shuō)明兩組小鼠具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 兩組造模前均禁食12 h，觀察組BALB/c小鼠灌胃給2×109CFU/mL濃度的幽門螺桿菌菌液，0.5 mL/d，連續(xù)7 d；對(duì)照組灌胃給生理鹽水，0.5 mL/d，連續(xù)7 d[3]。之后正常飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2 檢測(cè)血漿中γ干擾素(IFN-γ)、重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)以及IL-10的表達(dá)量 感染2周后，從各組小鼠眼眶靜脈叢采集小鼠的血液，感染4周后，采集小鼠的血液，并處死小鼠，無(wú)菌條件下取各組小鼠的胃黏膜組織。將血液樣本進(jìn)行離心3 500 r/min。采用Real-time PCR檢測(cè)感染2、4周后，小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達(dá)量。操作方法：首先，血漿總RNA的提取，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；其次，將得到的cDNA后進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)夾心法檢測(cè)胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平。取胃黏膜組織，勻漿，取上清液。儀器使用酶標(biāo)儀，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 觀察指標(biāo) 幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜的造模后，分別檢測(cè)感染2、4周后小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA的表達(dá)量，以及感染4周后，檢測(cè)胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1 感染2周后，兩組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達(dá)量 感染2周后，將兩組小鼠血漿中的IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較，觀察組IL-8 mRNA的表達(dá)量，明顯高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 感染2周后血漿中各指標(biāo)表達(dá)量的比較

2.2 感染4周后，兩組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達(dá)量 感染4周后，將兩組小鼠血漿中的IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA表達(dá)量進(jìn)行比較，IFN-γ、TNF-α以及IL-8的表達(dá)量，觀察組明顯高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 感染4周后血漿中各指標(biāo)表達(dá)量的比較

2.3 感染4周后，兩組小鼠胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白水平 感染4周后，將兩組小鼠胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10蛋白的水平進(jìn)行比較，觀察組IFN-γ、TNF-α以及IL-8蛋白的水平明顯高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 感染4周后胃黏膜組織中各指標(biāo)蛋白水平的比較

3 討論

幽門螺桿菌是一種呈S形或弧形彎曲狀的微需氧細(xì)菌，呈革蘭染色陰性[5-6]，寄生于胃黏膜上皮表面及胃內(nèi)黏膜層腺腔中。有研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病因素之一[7-9]。本文分析了幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織細(xì)胞因子變化，初步探討了幽門螺桿菌感染的免疫機(jī)制。

本組資料首先進(jìn)行幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織造模，結(jié)果顯示，各組小鼠感染2周后，觀察組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α以及IL-10 mRNA表達(dá)量和對(duì)照組小鼠血漿比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅IL-8明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。感染4周后，觀察組小鼠血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10的mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。觀察組胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、IL-8以及IL-10 mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。感染4周后，觀察組胃黏膜組織中IFN-γ、TNF-α、以及IL-8蛋白水平明顯高于對(duì)照組。

由于IFN-γ能夠增強(qiáng)各種炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性。TNF-α、IL-8均有很強(qiáng)的抗炎活性[10-11]。同時(shí)TNF-α能夠正向調(diào)節(jié)IL-8的產(chǎn)生。IL-8具有強(qiáng)大的多形核細(xì)胞趨化性及激活的功能[12-13]。但感染4周后，無(wú)論是血漿中的IL-10 mRNA表達(dá)量還是胃黏膜組織中IL-10蛋白的水平與對(duì)照組相比較，均無(wú)明顯變化。表明IL-10在幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜中上升不明顯，說(shuō)明幽門螺桿菌感染對(duì)TH2型細(xì)胞因子表達(dá)無(wú)明顯作用[14-15]。綜上所述，幽門螺桿菌感染小鼠胃黏膜組織，對(duì)TH2細(xì)胞作用表現(xiàn)不明顯，但能促進(jìn)TH1型細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)，引發(fā)TH1為主的免疫反應(yīng)。

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Experimental study of cytokines in gastric mucosa of mice with Helicobacter pylori infection*

HanYanzhi,LiuHao,RuanKaixue

(DepartmentofInternalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziMedicalUniversity,Shihezi,Xinjiang832008,China)

Objective To study the change of cytokines in gastric mucosa of mice with Helicobacter pylori infection and explore the immune mechanism.Methods Twenty-four 8-10 weeks-old BALB/c mice were randomly divided into observation group and control group.After first 12 hours of fasting,observation group was given 0.5 mL/d Helicobacter pylori bacterial liquid with concentration of 2×109CFU/mL for 7 consecutive days.The control group was fed with 0.5 mL/d saline for 7 consecutive days.Then the mice were infected with Helicobacter pylori gast model was established.Using Real-time PCR to detect the expressions of IFN-γ,TNF-α,IL-8 and IL-10 in murine plasma within 2,4 weeks after infection.And after 4 weeks of infection,mice were sacrificed,and their stomach tissue sterile were separated.ELISA was used to detect the levels of IFN-γ,TNF-α,IL-8,and IL-10 mRNA in gastric mucosa.Results There was significantly difference between groups 2 weeks after infection(P<0.05).With lastingness of infection,the expression and the mRNA of IFN-γ,TNF-α,IL-8 were significantly increased,and the rate of increase of observation group was higher(P<0.05).Conclusion TH2 cells may have no effect on Helicobacter pylori infection in mice gastric mucosa and promote the expression of TH1-type cytokines,triggering immune response of TH1.

Helicobacter pylori;gastric mucosa;cytokines;infection

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.03.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(49201065)。 作者簡(jiǎn)介： 韓巖智(1981-),主治醫(yī)師,碩士，主要從事消化內(nèi)科及消化疾病內(nèi)鏡診療方向研究。

R332

A

1671-8348(2015)03-0293-02

2014-09-08

2014-11-21)