劉硒碲，夏 寧，梁瑜禎

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳，南寧 530021)

·論著·

脂多糖誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的建立*

劉硒碲1，夏 寧2△，梁瑜禎1

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳，南寧 530021)

目的 探討通過(guò)單一皮下注射脂多糖(LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性炎癥的方法建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型的可行性。方法 將30只雄性Wistar大鼠分成對(duì)照組(n=10)和造模組(n=20)。造模組以LPS(300 μg·kg-1·d-1)皮下注射8周，對(duì)照組予以皮下注射等容量生理鹽水。每周對(duì)大鼠一般情況、體質(zhì)量、空腹血糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，8周后對(duì)兩組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及空腹胰島素(FINS)進(jìn)行測(cè)定，另外進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素釋放試驗(yàn)(IRT)。以空腹血糖大于或等于1.1 mmol/L為造模成功。結(jié)果 第6周開(kāi)始T2DM造模組大鼠血糖顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，達(dá)到T2DM大鼠模型的成模標(biāo)準(zhǔn)。與對(duì)照組比較，造模組大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1、FINS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；OGTT試驗(yàn),造模組血糖水平高于對(duì)照組,胰島素峰值低于對(duì)照組，(P<0.05)。結(jié)論 通過(guò)皮下注射小劑量LPS 成功地建立了T2DM大鼠模型,為糖尿病的病因研究提供了一定的幫助。

脂多糖類;糖尿病，2型;大鼠模型

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是以胰島素抵抗和低度慢性炎癥為特征的代謝性疾病，隨著人們生活模式的改變,T2DM在人群中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人們的健康與生命。到2050年，全球范圍內(nèi)糖尿病的患病率將增加3倍，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。通過(guò)近年來(lái)的研究認(rèn)識(shí)到，機(jī)體長(zhǎng)期的低度炎癥狀態(tài)在肥胖、胰島素抵抗、T2DM等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。本研究通過(guò)單一皮下注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性炎癥的方法研究長(zhǎng)期低度炎癥刺激對(duì)大鼠血糖的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠30只(80～100 g)，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠入組前經(jīng)過(guò)體檢及血液分析，健康狀況良好。LPS購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司生產(chǎn);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、IL-1、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；檢測(cè)血清胰島素rat-ELISA試劑盒購(gòu)自蘇州卡爾文生物科技有限公司。全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。羅氏血糖儀及試紙;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為日本東芝公司生產(chǎn);上海安亭TGL-16C臺(tái)式高速普通離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 SPF級(jí)雄性 Wistar 大鼠30只(80～100 g)均自由飲水，室溫控制在18～22 ℃，相對(duì)濕度30%～70%。各組大鼠每天自用同一種飼料，同組大鼠體質(zhì)量相差小于10%。自購(gòu)入起適應(yīng)一周后分為2組：造模組(n=20)和對(duì)照組(n=10)。LPS(血清型0127:B8，批號(hào)L-3129)臨用前以無(wú)菌生理鹽水溶解，-4 ℃保存。T2DM造模組以LPS 300 μg·kg-1·day-1行頸背部皮下注射。對(duì)照組在同一時(shí)間予以皮下注射等容量鹽水(9 g/L 氯化鈉注射液)。動(dòng)物共飼養(yǎng) 8周。

1.2.2 取材及指標(biāo)檢測(cè) 每周稱取各組大鼠體質(zhì)量，比較體質(zhì)量增加差異,測(cè)定尾靜脈空腹血糖進(jìn)行分析。8周后，大鼠經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采靜脈血，離心后取上清，分別檢測(cè)TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1、FINS。測(cè)定方法按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素釋放試驗(yàn)(IRT) 8周末，對(duì)照組和造模組大鼠均禁食12 h后，用50%葡萄糖以2 g/kg體質(zhì)量劑量灌胃，分別在灌胃前和灌胃后30、60、120 min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采靜脈血，血糖用羅氏血糖儀測(cè)定，胰島素經(jīng)ELISA測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 對(duì)照組大鼠體態(tài)活潑，皮毛干凈,有光澤,生長(zhǎng)良好。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、皮毛發(fā)黃、晦暗、反應(yīng)遲鈍,觀察發(fā)現(xiàn)有多飲、多尿、多食等DM癥狀。

2.2 大鼠體質(zhì)量變化 每周稱取大鼠體質(zhì)量，并繪制柱形圖。隨著喂養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，兩組大鼠體質(zhì)量均有不同程度的增長(zhǎng)。第5周開(kāi)始造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較對(duì)照組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

2.3 兩組大鼠空腹血糖動(dòng)態(tài)變化 模型組大鼠給藥后,血糖呈先升高后下降趨勢(shì)。經(jīng)t檢驗(yàn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。以空腹血糖大于或等于 11.1 mmol/L為造模成功。

圖1 兩組大鼠體質(zhì)量變化圖

圖2 兩組大鼠血糖變化圖

2.4 8周后兩組大鼠血清中炎癥因子及空腹胰島素變化 與對(duì)照組比較，造模組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1，F(xiàn)INS水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1、FINS變化

a:P<0.05，與對(duì)照組比較。

圖3 兩組大鼠OGTT變化圖

圖4 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平比較圖

2.5 OGTT 8周末禁食 12 h，OGTT顯示，以50%葡萄糖 2 g/kg 灌胃后，對(duì)照組和造模組血糖均在60 min達(dá)到高峰。但造模組血糖在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組，達(dá)到T2DM造模標(biāo)準(zhǔn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.6 IRT 8周末，行OGTT時(shí)胰島素結(jié)果顯示，造模組各時(shí)間點(diǎn)胰島素水平均高于對(duì)照組，且高峰出現(xiàn)在120 min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

3 討論

建立T2DM動(dòng)物模型的目的在于模擬T2DM的發(fā)病因素、病理生理過(guò)程和臨床特征,從而為T2DM的防治提供合理、有效的方法。近年來(lái)，從基礎(chǔ)研究、臨床試驗(yàn)以及流行病學(xué)研究都顯示機(jī)體長(zhǎng)期的低度炎癥狀態(tài)是胰島素抵抗、糖尿病等代謝性疾病的一個(gè)重要的發(fā)病機(jī)制，炎癥過(guò)程產(chǎn)生的炎癥因子影響胰島素的信號(hào)通路，引起胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)T2DM。無(wú)論是動(dòng)物模型還是人體實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)了肥胖、T2DM個(gè)體中存在著腸道菌群數(shù)量和組成的變化，同時(shí)伴隨著LPS含量升高[2-5]。LPS是存在于革蘭陰性細(xì)菌外膜的一種內(nèi)毒素，細(xì)菌破解后被釋放，是革蘭陰性菌感染時(shí)激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)，啟動(dòng)炎性反應(yīng)的主要成分。許多代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展都與LPS有著密切的關(guān)系[6-7]。

LPS 進(jìn)入機(jī)體后首先與血漿中的LPS 結(jié)合蛋白(LBP) 結(jié)合，再結(jié)合于細(xì)胞表面的CD14分子，以LPS-LBP-CD14復(fù)合物的形式與單核巨噬細(xì)胞膜上的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合導(dǎo)致 TLR4 的聚合而活化。LPS 還可激活絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK) 通路，二者均可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的大量表達(dá)[8]。本研究證實(shí)，通過(guò)皮下注射小劑量LPS 8周后，與對(duì)照組比較，造模組血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

本研究通過(guò)單一皮下注射小劑量LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性炎癥的方法研究長(zhǎng)期、低度炎癥刺激對(duì)大鼠血糖的影響，結(jié)果如圖2所示，與Cani等[9]的研究一致，模型組大鼠的血糖顯著高于對(duì)照組，達(dá)到T2DM大鼠的成模標(biāo)準(zhǔn)。目前有關(guān)炎癥因子引起胰島素抵抗的途徑及機(jī)制已較為清楚,主要通過(guò)作用于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)胰島素[10-11]。如TNF-α、MCP-1水平的上升能促進(jìn)胰島素受體底物1(IRS-1)的絲氨酸磷酸化。IRS-1是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要信號(hào)蛋白，絲氨酸/酪氨酸磷酸化是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要環(huán)節(jié)。IRS-1的絲氨酸磷酸化減弱胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的同時(shí)干擾正常酪氨酸的磷酸化，從而導(dǎo)致IRS-1對(duì)胰島素敏感性下降，產(chǎn)生胰島素抵抗。胰島素抵抗發(fā)生是T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)。但Cani等[9]的研究表明血清胰島素與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠與對(duì)照組比較空腹胰島素顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其原因可能是Cani等[9]研究中持續(xù)注射LPS 4周，而本研究持續(xù)注射了8周。表明通過(guò)持續(xù)皮下注射LPS，長(zhǎng)期的低度炎癥刺激可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗并引起糖代謝異常。與此同時(shí)，與Dandona等[12]通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗及T2DM的結(jié)果一致，第 5 周開(kāi)始模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較對(duì)照組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明經(jīng)過(guò)LPS刺激產(chǎn)生慢性低度炎癥干擾了機(jī)體正常的能量代謝，進(jìn)而產(chǎn)生肥胖、胰島素抵抗。通過(guò)OGTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):8周末造模組各時(shí)間點(diǎn)血糖均高于對(duì)照組，在 120 min血糖水平仍然較高,達(dá)到T2DM造模標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)檢測(cè)胰島素水平發(fā)現(xiàn)造模組高峰后延至120 min。與以往研究中發(fā)現(xiàn)的T2DM胰島素分泌往往存在早期相受損，晚期相延遲這個(gè)理論相符。從而進(jìn)一步說(shuō)明該模型符合T2DM的特點(diǎn)。

本研究采用持續(xù)皮下注射小劑量LPS成功地建立了大鼠T2DM模型,模擬臨床慢性低度炎癥和胰島素抵抗引發(fā)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為進(jìn)一步闡明慢性炎癥和胰島素抵抗與T2DM等代謝性疾病關(guān)系的分子機(jī)制提供了一定的幫助。采用本方法建立動(dòng)物模型,無(wú)一只大鼠死亡，成功率高,方法比較簡(jiǎn)單,對(duì)其他器官組織影響小。可作為針對(duì)慢性低度炎癥導(dǎo)致胰島素抵抗、T2DM的信號(hào)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行靶向藥物的研發(fā)，當(dāng)然，這只是小樣本的實(shí)驗(yàn)，要想得到更為肯定的結(jié)果，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來(lái)證實(shí)。

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Establishing a type 2 diabetes model in rats by lipopolysaccharide*

LiuXidi1,XiaNing2△,LiangYuzhen1

(1.DepartmentofNutrition,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China;2.theHealthDepartmentofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To establish rat model of type 2 diabetes through a single subcutaneous injection of lipopolysaccharide which induced chronic inflammation.Methods The male Wistar rats(n=30)were randomly divided control group (n=10) and model group (n=20).Model group with LPS (300 μg·kg-1·day-1) subcutaneous injection of eight weeks,rats in control group received isometric stroke-physiological saline solution injection in the same way.The changes in appearance,weight and fasting blood glucose (FBG) of rats were observed every week.At the end of the 8th week,thelevels of tumor necrosis factor a (TNF-α),interleukin-1(IL-1),interleukin-6 (IL-6),monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) and fasting insulin(FINS)were measured.Oral glucose tolerance test (OGTT) and insulin release test(IRT)were also performed.The successful rat model was determined by the standards that FBG was ≥11.1 mmol /L.Results Model group rats reached the standard of type 2 diabetes after six weeks of LPS injection.Model group blood sugar is significantly higher than the control group (P<0.05).In addition,model group′s expression level of inflammatory cytokines in serum TNF-α,IL-1,IL-6,MCP-1 and FINS were significantly higher than control group (P<0.05).Oral glucose tolerance test,blood glucose levels higher than normal in model group,the insulin peak is lower than the normal group (P<0.05).Conclusion The success of establishing the animal model of type 2 diabetic rats which were injected of low dose of LPS by subcutaneous may be provide certain help for the etiology of diabetes research.

lipopolysaccharide;diabetes mellitus,type 2;rat model

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.06.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(8160070)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053083)。 作者簡(jiǎn)介：劉硒碲(1984-),在讀博士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究工作?！?/p>

，E-mail:xianing12@aliyun.com。

R574

A

1671-8348(2015)06-0727-03

2014-08-15

2014-11-15)