邱宇安,陳火國(guó),李麗紅,靳文劍,黃紹烈

(1.江西省腫瘤醫(yī)院ICU,南昌 330029；2.江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)四科,南昌 330029；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南昌 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

黃芪含藥血清對(duì)血管緊張素Ⅱ致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用*

邱宇安1,陳火國(guó)2,李麗紅2,靳文劍2,黃紹烈3

(1.江西省腫瘤醫(yī)院ICU,南昌 330029；2.江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)四科,南昌 330029；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南昌 330006)

目的 觀察血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的致凋亡效應(yīng)及黃芪含藥血清的保護(hù)作用。方法 將培養(yǎng)的ECV-304分為以下3組：(1)空白對(duì)照組；(2)AngⅡ誘導(dǎo)組，使培養(yǎng)基中AngⅡ終濃度為0、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L，與細(xì)胞共孵育18 h。MTT法檢測(cè)AngⅡ?qū)UVECs生長(zhǎng)增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)AngⅡ作用后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的變化；電子顯微鏡觀察AngⅡ誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；(3)黃芪含藥血清干預(yù)組，培養(yǎng)基中加入不同濃度黃芪含藥血清培養(yǎng)24 h后，加入AngⅡ(1×10-4mol/L)孵育18 h，檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果 不同濃度的AngⅡ均能抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。不同濃度的AngⅡ均可顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。透射電鏡下可見AngⅡ誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡形態(tài)。黃芪含藥血清抑制AngⅡ所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。結(jié)論 黃芪含藥血清具有內(nèi)皮保護(hù)作用。

血管緊張素Ⅱ；內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；黃芪

血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在As發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[1-2]。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是已知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)之一，它有多種效應(yīng)參與As 進(jìn)程[3-5]。中藥黃芪具有益氣養(yǎng)血之功效，黃芪注射液在臨床上可用于冠心病及糖尿病腎病的治療[6-7]。本課題旨在觀察AngⅡ致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡效應(yīng)及黃芪含藥血清的內(nèi)皮保護(hù)作用，探討了AngⅡ與As發(fā)生的關(guān)系和黃芪含藥血清的內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 黃芪(江西省中醫(yī)院中藥房)；Wistar大鼠(南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；AnnexinV-FITC/PI試劑盒(美國(guó)BD公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；AngⅡ原粉、MTT(美國(guó)Sigma公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(芬蘭 Thermo bioanalysis 公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BeckmanCoulter公司)；Titachi H-600 電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 黃芪含藥血清的制備 將黃芪水煎煮并濃縮至生藥1g/mL。20只Wistar大鼠分入空白組、黃芪小劑量組、黃芪中劑量組和黃芪高劑量組。黃芪以成人臨床日用量的大鼠等效劑量之1、2、4倍分別定義小、中、大劑量。每次灌藥液4 mL，空白組灌等量生理鹽水。在1周內(nèi)連續(xù)每天給藥2次，于末次給藥2 h后心臟取血。于4 ℃靜置2 h，低溫離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，分離血清。56 ℃恒溫滅活補(bǔ)體30 min后，0.22 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃低溫保存，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)ECV-304，0.25%胰酶及0.02%EDTA用于消化傳代細(xì)胞。接種ECV-304于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組和AngⅡ組，各組培養(yǎng)基中AngⅡ終濃度分別為1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L，培養(yǎng)18 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞活力及凋亡率。黃芪含藥血清實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(不作任何處理)，空白對(duì)照組(加生理鹽水)，黃芪含藥血清小、中、大劑量組，培養(yǎng)基中加入不同濃度黃芪含藥血清培養(yǎng)24 h后，再加入AngⅡ(1×10-4mol/L)孵育18 h，檢測(cè)該組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的變化。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，小心棄去上清液，PBS洗滌2～3次，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜。低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞消化收集后，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞密度為5×105～1×106/mL，取1 mL細(xì)胞用PBS離心洗滌，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，共離心3次，棄上清液。將細(xì)胞重懸浮于200 μL結(jié)合緩沖液。加入10 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 電鏡觀察 收集細(xì)胞，離心沉淀后棄上清，2.5%戊二醛固定3 h，磷酸緩沖液清洗，丙酮梯度脫水，1%四氧化鋨固定1.5 h，樹脂包埋后進(jìn)行超薄切片，經(jīng)鈾和鉛雙重染色后，置于透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：與空白對(duì)照組比較，不同濃度的AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖均有抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且隨著AngⅡ濃度增加，抑制作用越明顯。見表1。

表1 AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

a：P<0.01，與空白對(duì)照組比較；b：P<0.05，與1×10-6mol/L比較；c：P<0.05，與1×10-5mol/L比較。

2.2 AngⅡ致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡效應(yīng) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同AngⅡ濃度組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，結(jié)果提示，在AngⅡ作用下，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯增加。與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AngⅡ濃度越高，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率越高，見表2。

表2 AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

a：P<0.01，與空白對(duì)照組比較；b：P<0.05，與1×10-5mol/L比較。

圖1 電鏡下凋亡內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡×8 000)

2.3 電鏡下凋亡內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后，見細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，呈團(tuán)塊狀，表現(xiàn)為凋亡改變,見圖1。

2.4 黃芪含藥血清對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度黃芪含藥血清培養(yǎng)24 h后，加入AngⅡ(1×10-4mol/L)孵育18 h，流式細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果表明，不同濃度的黃芪含藥血清均可使AngⅡ所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯下降。提示黃芪含藥血清有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用,見表3。

表3 黃芪含藥血清對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

a:P<0.01，與陰性對(duì)照組比較;b:P<0.01,與空白對(duì)照組比較；c:P<0.05，d：P<0.01，與黃芪含藥血清小劑量組比較。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血液與血管組織之間。它能合成和分泌多種活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生理功能。主要包括調(diào)節(jié)血管張力及血壓水平、維持凝血和纖溶系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的趨化、黏附和聚集等[8-9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷將有利于單核細(xì)胞的趨化遷移和脂質(zhì)的沉積，導(dǎo)致As的發(fā)生。本研究證實(shí)AngⅡ可以通過誘導(dǎo)凋亡來產(chǎn)生抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的效應(yīng)，此結(jié)果與國(guó)外學(xué)者M(jìn)arampon等[10]研究結(jié)果相一致。說明AngⅡ能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷參與As的發(fā)生、發(fā)展。

東漢《金匱要略》上即記載有方劑“黃芪桂枝五物湯”，以黃芪為君藥，主治血痹之證。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黃芪具有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫等功效[11]。楊慶有等[12]證實(shí)黃芪可以減輕心肌鈣超載損傷，改善心肌的收縮和舒張功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芪具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[13]。黃芪注射液可能通過加強(qiáng)對(duì)氧自由基的清除,維持血管內(nèi)皮正常的功能[14]。本研究從細(xì)胞凋亡的角度探討了黃芪含藥血清的內(nèi)皮保護(hù)作用，此前未見報(bào)道。過程中，采用中藥血清藥理學(xué)研究方法，將中藥給大鼠灌服后，用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，更接近藥物在體內(nèi)作用的真實(shí)過程[15]。相比直接使用中藥粗制劑，可信度更高。

本研究觀察到AngⅡ所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡能被黃芪含藥血清所抑制，說明黃芪含藥血清具有明確內(nèi)皮保護(hù)作用。但黃芪成分復(fù)雜，作用廣泛。具體是哪種有效成分，通過何種具體機(jī)制，產(chǎn)生抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，有待于進(jìn)一步深入研究與探討。

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Protective effects of serum contained huangqi on endothelial cell apoptosis induced by angiotensinⅡ*

QiuYu′an1,ChenHuoguo2,LiLihong2,JinWenjian2,HuangShaolie3

(1.DepartmentofICU,JiangxiCancerHospital,Nanchang,Jiangxi330029,China;2.DepartmentofInternal4Ward,JiangxiCancerHospital,Nanchang,Jiangxi330029,China;3.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To study AngⅡinduced apoptosis of HUVECs and to observe the protective effect of serum contained huangqi on endothelial cell.Methods ECV-304 cells were randomly divided into control group,AngⅡgroup and huangqi group.In the control group,cells were cultured for 18 h,and the concentration of AngⅡ were 0 mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L and 1×10-4mol/L.The cell proliferation was measured by MTT assay.Electron microscope was used to observe the change of HUVECs.Ultrastructure of HUVECs induced by AngⅡ was observed by electron microscope.In the huangqi group,serum contained huangqi of different concentration were added into the medium and cultured for 24 h,then AngⅡ of 1×10-4mol/L was included and cultured for 18 h,and the apoptosis ratio induced by AngⅡwas measured by flow cytometry.Results AngⅡof different concentration could all significantly inhibit HUVECs proliferation.AngⅡof different concentration could all induce endothelial cell apoptosis.HUVECs apoptosis was observed by electron microscope.HUVECs apoptosis induced by AngⅡcould be inhibited by serum contained huangqi.Conclusion Serum contained huangqi could protect endothelial cells.

angiotensin Ⅱ;endothelial cell;apoptosis;huangqi

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.06.008

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥基金項(xiàng)目(2011A061)。 作者簡(jiǎn)介：邱宇安(1977-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事中醫(yī)研究。

R285.5

A

1671-8348(2015)06-0741-02

2014-10-15

2014-12-10)