王昌明，禤秀萍

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林 541001)

論著·基礎(chǔ)研究

青蒿琥酯對肺纖維化大鼠熱休克蛋白47表達的影響*

王昌明，禤秀萍

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西桂林 541001)

目的 探討青蒿琥酯對肺纖維化大鼠熱休克蛋白47(Hsp47)表達的影響。方法 雄性SD大鼠30只，分為對照組、模型組和青蒿琥酯干預(yù)組(簡稱干預(yù)組)。對照組一次性氣管內(nèi)滴入生理鹽水約0.4 mL，模型組和干預(yù)組一次性氣管內(nèi)滴入博來霉素5 mg/kg。對照組和模型組次日每天腹腔注射生理鹽水1.0 mL。干預(yù)組每天腹腔注射青蒿琥酯10 mg/100 g。記錄0、14、28 d大鼠的體質(zhì)量。各組大鼠于第28天處死，計算肺系數(shù)，取肺組織進行蘇木精-伊紅(HE)染色、Masson染色、羥脯氨酸檢測和Hsp47、Ⅰ型膠原RT-PCR和Western blot檢測。結(jié)果 (1)對照組大鼠體質(zhì)量增長明顯高于其他兩組(P<0.05)。(2)肺系數(shù):模型組[(12.31±1.89)mg/g]>干預(yù)組[(8.54±0.67)mg/g]>對照組[(4.81±0.38)mg/g]，P<0.05。(3)Ashcroft評分:模型組[(5.70±1.09)分]>對照組[(3.08±0.56)分],模型組[(5.70±1.09)分]>干預(yù)組[(4.01±1.25)分],P<0.05；對照組和干預(yù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(4)羥脯氨酸含量:模型組(620.33±66.16)μg/g>對照組(379.00±35.51)μg/g,模型組(620.33±66.16)μg/g>干預(yù)組(429.00±36.51)μg/g,P<0.05；對照組和干預(yù)組間差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。(5)Hsp47 mRNA：模型組高于對照組，模型組和干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。Ⅰ型膠原mRNA：模型組>干預(yù)組>對照組(P<0.05)。(6)Hsp47蛋白表達水平模型組明顯高于對照組和干預(yù)組。結(jié)論 青蒿琥酯可能通過下調(diào)Hsp47表達水平來抑制膠原的合成進而減輕肺纖維化。

肺纖維化；Hsp47熱休克蛋白質(zhì)類；青蒿琥酯

肺纖維化是一種進行性發(fā)展的以細胞外膠原過度沉積為特征的間質(zhì)性肺疾病。臨床上尚無有效的治療方法。肺纖維化的病因仍未明確，共同的病理改變表現(xiàn)為肺泡上皮的損傷，成纖維細胞的增殖和大量的膠原沉著。

熱休克蛋白47(heat shock protein 47，Hsp47)是膠原特異性分子伴侶，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，參與前膠原的加工、折疊、合成及分泌,起著質(zhì)量監(jiān)控作用,避免產(chǎn)生和分泌錯誤結(jié)構(gòu)的前膠原[1]。在肺纖維化進展過程中，纖維化的病變區(qū)域及其附近都能檢測到Hsp47[2-3]。肺纖維化中肌成纖維細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、F4/80陽性的巨噬細胞均表達Hsp47[4]。Hsp47可以作為產(chǎn)生膠原細胞的表型標(biāo)志[5]。目前有很多研究顯示通過使用Hsp47反義寡核苷酸探針能夠明顯減輕大鼠肺纖維化程度且可以降低實驗動物的病死率[6-7]，而且通過Hsp47條件性基因敲除的方法可以使細胞外膠原含量明顯降低[8]。抑制Hsp47表達可以減輕肺纖維化。Hsp47可以作為膠原相關(guān)疾病治療的潛在位點[9]。

青蒿素是從菊科艾屬黃花蒿莖葉中提取的一種含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯,經(jīng)化學(xué)改造可生成多種衍生物,如雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。作者前期研究表明青蒿琥酯能夠減少人胚肺成纖維細胞膠原的產(chǎn)生[10]。但青蒿琥酯通過何種途徑減少膠原的產(chǎn)生仍需進一步探討。本實驗將從青蒿琥酯能否通過下調(diào)Hsp47表達來影響膠原的產(chǎn)生以研究青蒿琥酯的抗纖維化機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及配制 注射用鹽酸博來霉素(1.5萬博來霉素單位/支)購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H20055883,批號120101)，使用時3 mL生理鹽水稀釋，濃度為5 mg/mL；注射用青蒿琥酯(60 mg/支)購于桂林南藥股份有限公司(國藥準(zhǔn)字H10930195,批號LA120920)，使用時1 mL碳酸氫鈉充分溶解，再用2 mL生理鹽水稀釋，濃度為20 mg/mL；羥脯氨酸測試盒(堿水解法)購于南京建成生物工程研究所；Hsp47抗體購于Abcam公司；Trizol試劑盒、2×TaqPCRMasterMix均購于天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司；引物由上海英俊公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 雄性SD大鼠180～250 g 30只，購于桂林醫(yī)學(xué)院SPF實驗動物中心，按抽簽的方法隨機分為對照組、模型組和青蒿琥酯干預(yù)組(簡稱干預(yù)組)。對照組8只,模型組132只，干預(yù)組9只。

1.2.2 動物模型復(fù)制 乙醚吸入麻醉后將大鼠仰臥固定于試驗臺上，頸前部脫毛后用碘伏消毒，剪開皮膚后逐層鈍性分離暴露氣管。用1 mL的注射器注射約0.4 mL生理鹽水(對照組)或5 mg/kg博來霉素(模型組和干預(yù)組)，在氣管軟骨環(huán)間刺入，稍微往氣管軟骨環(huán)方向進針注入液體，立即將動物直立，左右搖晃，盡量使液體在肺內(nèi)分布均勻。逐層縫合頸部肌肉和皮膚。對照組和模型組次日每天注射生理鹽水1.0 mL。干預(yù)組次日每天注射青蒿琥酯10 mg/100 g,觀察每組大鼠的體質(zhì)量變化，各組大鼠于第28天處死。

1.2.3 實驗動物取材 10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后，開胸暴露氣管后沿氣管進行鈍性分離，取出肺臟，用預(yù)冷的DEPC清洗，盡量洗凈血絲后，用濾紙吸干，稱取全肺濕質(zhì)量，計算肺系數(shù)。取右肺組織用凍存管裝好后置于液氮中轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱中凍存，其中右上肺用于羥脯氨酸測定，其余用于分子生物學(xué)檢測。取左肺置于10% 甲醛中固定24 h后，用于HE染色、Masson染色。

1.2.4 Hsp47、Ⅰ型膠原mRNA檢測 按Trizol試劑盒說明書提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。Hsp47上游引物序列5′-AGA ACC AAG GCA GAC TTA TCG C-3′，下游引物序列5′-CCG TAG ATG TCC TGG TCA AAG-3′，產(chǎn)物大小為121 bp。Ⅰ型膠原上游引物序列5′-GGC TTC AAA GGC ATT CGA GGA C-3′，下游引物序列5′-GCT CCG ACA CGC CCT CTC TC-3′，產(chǎn)物大小為158 bp。選GAPDH為內(nèi)參照，上游引物序列5′-GTG CTG AGT ATG TCG TGG AG -3′，下游引物序列5′-ACC AGT GGAT GCA GGG AT-3′，引物大小為365 bp。逆轉(zhuǎn)錄的條件為：第一步42 ℃,2 min。第二步37 ℃,15 min;85 ℃,5 s,4 ℃保存。PCR的條件為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)30次;72 ℃ 5 min,4 ℃保存。

1.2.5 Hsp47 Western blot檢測 提取肺組織總蛋白，測定總蛋白含量，根據(jù)蛋白濃度使每孔蛋白上樣體積為12 μL,蛋白量30 μg。行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min,加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入發(fā)光液后暗室曝光。內(nèi)參選用GAPDH,一抗室溫孵育1.5 h,二抗1.0 h，其余反應(yīng)條件和步驟與Hsp47相同。

1.3 觀察指標(biāo) (1)大鼠一般狀態(tài)觀察，觀察大鼠毛發(fā)、精神、活動、食欲、有無啰音、體質(zhì)量變化,觀察大鼠病死率。(2)肺臟大體觀察，計算肺系數(shù)，稱取濕肺質(zhì)量，肺系數(shù)=肺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。(3)羥脯氨酸測定，取右上肺組織解凍后嚴(yán)格按照說明書操作。(4)病理形態(tài)學(xué)觀察，10%福爾馬林固定后，制備蠟塊，進行HE染色和Masson染色。光鏡下觀察HE染色、Masson染色。評價纖維化程度，采用Ashcroft評分標(biāo)準(zhǔn)[17]。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)的改變 對照組毛發(fā)光滑，呼吸平穩(wěn)，活動度正常，食欲尚可，多數(shù)無啰音，少數(shù)術(shù)后1～2 d內(nèi)有啰音。模型組和青蒿琥酯干預(yù)組進食顯著減少，毛發(fā)蓬松無光澤，呼吸急促，腹式呼吸明顯，精神萎靡，活動少，常閉眼蜷縮，啰音非常明顯且術(shù)后持續(xù)時間較長，有部分模型組大鼠第14天仍可聞及明顯啰音。術(shù)后飼養(yǎng)過程中，模型組有7只大鼠死亡，干預(yù)組有3只大鼠死亡，對照組無死亡。對照組大鼠的體質(zhì)量逐漸上升，少數(shù)術(shù)后2～3 d體質(zhì)量下降，之后上升。模型組和干預(yù)組體質(zhì)量減輕明顯，術(shù)后第6天左右降至最低，最后逐漸緩慢上升。第28天時對照組體質(zhì)量顯著高于模型組和干預(yù)組，而模型組和干預(yù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后體質(zhì)量變化

a:P<0.05，與對照組比較。

表2 各組大鼠肺系數(shù)、羥脯氨酸含量和Ashcroft評分

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05,與模型組比較。

2.2 各組肺臟大體外觀、大鼠肺系數(shù)、羥脯氨酸含量 肺臟大體觀：對照組肺臟較光滑，質(zhì)地均勻，呈粉紅色。模型組和干預(yù)組肺臟體積增大，顏色灰暗，表面凹凸不平，可見灰白色結(jié)節(jié)甚至肺大泡。肺系數(shù)：模型組>干預(yù)組>對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。羥脯氨酸含量：模型組>對照組(P<0.05)，模型組>干預(yù)組(P<0.05)，對照組和干預(yù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 HE染色可見對照組肺泡結(jié)構(gòu)較完整，肺泡壁輕微增厚，少量點灶狀纖維化灶，炎癥細胞浸潤不明顯。模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，可見大片的實變區(qū)域，大量炎癥細胞浸潤，可見較多均質(zhì)淡染的纖維條索。干預(yù)組肺泡結(jié)構(gòu)破壞較模型組輕，實變區(qū)域較少，可見炎細胞浸潤，纖維條索灶較少，見圖1。Masson染色可見模型組肺組織膠原表達量(藍色區(qū)域)明顯比對照組和干預(yù)組高，見圖1。Ashcroft評分模型組>對照組(P<0.05)，模型組>干預(yù)組(P<0.05)，對照組和干預(yù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

1：對照組；2：模型組；3：干預(yù)組；a:HE染色(×100)；b:Masson染色(×100)。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

M:marker；1：對照組；2：模型組；3：干預(yù)組。

圖2 青蒿琥酯對Hsp47、Ⅰ型膠原mRNA表達的影響

表3 各組Hsp47和Ⅰ型膠原mRNA相對表達量

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05,與模型組比較。

1:對照組;2:模型組;3:干預(yù)組。

圖3 青蒿琥酯對Hsp47蛋白表達的影響

2.4 RT-PCR檢測Hsp47mRNA、Ⅰ型膠原mRNA的表達情況 模型組>干預(yù)組>對照組(P<0.05),但Hsp47 mRNA干預(yù)組和模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2，表3。

2.5 Western blot檢測Hsp47蛋白表達水平 模型組>對照組，模型組>干預(yù)組，見圖3。

3 討論

細胞外大量膠原沉著是肺纖維化的重要病理學(xué)特征，本研究通過復(fù)制大鼠肺纖維化模型，觀察青蒿琥酯對膠原特異性分子伴侶Hsp47表達的影響，探討青蒿琥酯抑制膠原產(chǎn)生與Hsp47的關(guān)系，為青蒿琥酯治療和預(yù)防肺纖維化提供理論依據(jù)。

羥脯氨酸在膠原中含量占13.4%,彈性蛋白中含量極少，其他蛋白均無，測定羥脯氨酸含量可以間接反映膠原含量。肺系數(shù)早期增加是由于炎性滲出，毛細血管充血等改變引起的。炎癥逐漸消退，膠原沉積是引起晚期肺系數(shù)增大的主要原因[11]。炎性反應(yīng)向纖維化轉(zhuǎn)變的時期大概是造模后第9天左右[12]。根據(jù)本次造模時間可以認為肺系數(shù)可以作為反映肺纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示青蒿琥酯能夠顯著減少肺纖維化形成過程中羥脯氨酸含量和降低肺系數(shù)，這與Ashcroft評分和Ⅰ型膠原mRNA的結(jié)果相一致，即青蒿琥酯能夠減少膠原的含量，減輕纖維化。這與作者前期“青蒿琥酯能抑制人胚肺成纖維細胞膠原產(chǎn)生的發(fā)現(xiàn)”[10]相吻合。

Hsp47是膠原特異性分子伴侶，對膠原的合成、分泌起著重要作用。Western blot的結(jié)果表明博來霉素能夠誘導(dǎo)Hsp47表達增加，青蒿琥酯干預(yù)能夠顯著降低該蛋白水平。這與膠原的變化趨勢相同。所以作者推論青蒿琥酯能夠抑制肺纖維化中Hsp47的表達進而減少膠原含量，減輕肺纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對Hsp47 mRNA的表達影響并不十分明顯，但卻能顯著降低該蛋白的表達。所以作者推測青蒿琥酯可能在轉(zhuǎn)錄后水平影響Hsp47的表達，具體作用于哪個環(huán)節(jié)仍需進一步研究。

綜上所述，青蒿琥酯能夠通過抑制Hsp47表達來下調(diào)Ⅰ型膠原表達水平，減輕肺纖維化。這為臨床上治療肺纖維化提供一定的參考。

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The effect of artesunate on heat shock protein 47 expression in rats of pulmonary fibrosis*

WangChangming,XuanXiuping

(DepartmentofRespiratoryMedicine,theAfflictedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin,Guangxi541001,China)

Objective To investigate the effect of artesunate on the expression of heat shock protein 47(Hsp47) in pulmonary fibrosis in rats.Methods Thirty SD male rats were randomly divided into control group,model group and artesunate intervention group (intervention group).Rats in control group were intrachacheally instilled with saline (0.4 mL),while rats in other two groups 5 mg/kg bleomycin.Rats in both control group and model group were intraperitoneal injected with 1 mL saline per day subsequently.And the rats in intervented group were intraperitoneal injected with 10 mg/100 g artesunate per day.The body weight of day 0,day 14 and day 28 were recorded.All the rats were sacrificed on day 28.The pulmonary coefficient and the hydroxyproline content were observed.The expression of Hsp47mRNA and CollagenⅠmRNA were evaluated by RT-PCR.The Hsp47 expression was also detected by Western Blot.The pathological changes were analyzed by hamatoxylin-eosin (HE) stain and Masson stain.Results (1)The body weight of control group grew much faster than other groups (P<0.05).(2)Pulmonary coefficient:model group (12.31±1.89)mg/g>intervention group (8.54±0.67)mg/g>control group(4.81±0.38)mg/g (P<0.05).(3)Ashcroft Scores:model group(5.70±1.09 )>control group (3.08±0.56),model group(5.70±1.09)>intervention group (4.01±1.25).There was no significant difference between control group and intervention group(P>0.05).(4)Hydroxyproline content:model group (620.33±66.16)μg/g>control group(379.00±35.51)μg/g,model group (620.33±66.16)μg/g >intervention group(429.00±36.51)μg/g (P<0.05),there was no significant difference between control group and intervention group.(5)Hsp47mRNA expression:model group and intervention group > control group (P<0.05),there was no difference between the first two groups(P>0.05).CollagenⅠmRNA:model group > intervention group>control group (P<0.05).(6)Western blot showed that Hsp47 expression of model group was the highest in all three groups.Conclusion These results indicate that artesunate might inhibit pulmonary fibrosis and depress CollagenⅠproduction,and it′s probably a result of Hsp47 down regulation.

pulmonary fibrosis;Hsp47 heat shock protein;artesunate

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.06.005

廣西自然科學(xué)基金資助項目(2011GXNSFA018220)。 作者簡介：王昌明(1963-)，教授，博士，主要從事肺纖維化、慢阻肺研究。

R714.253

A

1671-8348(2015)06-0732-04

2014-08-21

2014-09-27)