余貽漢，楊建美，趙 莉，徐 沙，汪 毅

中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用

余貽漢，楊建美，趙 莉，徐 沙，汪 毅*

目的 探討中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用。方法 以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，采用DSS飲水法建立結(jié)腸炎模型，隨機(jī)分為4組：模型組、中藥制劑組、美沙拉嗪組、美沙拉嗪+中藥制劑組，分別于第4天給予生理鹽水、中藥制劑、美沙拉嗪、美沙拉嗪聯(lián)合中藥制劑灌胃。每日觀察各組小鼠精神狀態(tài)、大便性狀及體重變化；于第10天收集小鼠糞便行隱血測(cè)定，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)；斷頸處死各組小鼠，取結(jié)腸炎病變嚴(yán)重部位測(cè)定髓過(guò)氧化物酶活力(MPO)；取結(jié)腸炎病變嚴(yán)重部位做病理切片，行HE染色評(píng)價(jià)病變嚴(yán)重程度。結(jié)果 成功建立小鼠結(jié)腸炎模型，各治療組的DAI、MPO和組織學(xué)評(píng)分均較模型組明顯改善，其中聯(lián)合治療組較美沙拉嗪組明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 復(fù)方中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪治療不僅能改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的癥狀評(píng)分，也能改善其病理評(píng)分。

中藥制劑；美沙拉嗪；結(jié)腸炎；DSS

0 引言

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcer colitis，UC)是一種腸道的非特異性炎癥性疾病，以反復(fù)發(fā)作的粘液膿血便為主要臨床表現(xiàn)。近年來(lái)，我國(guó)UC的發(fā)病率逐年上升[1]。目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在感染因素、遺傳因素、環(huán)境因素及自身免疫因素4個(gè)方面[2]，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，目前應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療藥物主要有：氨基水楊酸類、激素類、免疫抑制劑、生物制劑及中藥類[3]。Meta分析結(jié)果顯示，美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎在有效率、緩解率方面均優(yōu)于安慰劑組[4]，但其治療周期長(zhǎng)、停藥易復(fù)發(fā)、價(jià)格昂貴，患者難以長(zhǎng)期堅(jiān)持使用。近年研究表明，美沙拉嗪聯(lián)合中藥治療UC的療效較好[5-6]。本研究旨在研究美沙拉嗪(美沙拉嗪緩釋顆粒劑)聯(lián)合中藥制劑對(duì)小鼠UC模型的治療效果。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑 中藥制劑的組方包括：黃連5 g，白頭翁15 g，石榴皮15 g，五倍子10 g，總量45 g，置于1 000 mL燒杯中，加適量純化水浸泡30 min，煮沸后微沸30 min，濾出頭煎藥渣加適量水煮沸后微沸30 min，濾出二煎，合并兩次煎液靜置沉淀后加熱濃縮至100 mL，中藥藥液濃度為含生藥0.45 g/mL，藥原液裝瓶，高壓消毒后密封保存?zhèn)溆?，中藥制劑灌胃劑量?.2 mL/10 g體重，相當(dāng)于9 mg/g體重。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium，DSS，美國(guó)Sigma公司)，美沙拉嗪(法國(guó)愛的發(fā)制藥集團(tuán)，批號(hào)：H20100063)，髓過(guò)氧化物酶試劑盒(購(gòu)自南京建成科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及模型建立 C57BL/6小鼠40只，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0004]，6～8周齡，18～22 g，雌雄不限，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(鄂)2010-0057]，適應(yīng)性喂養(yǎng)至少7 d。將小鼠隨機(jī)分為4組：模型組、中藥制劑組(中藥組)、美沙拉嗪組及美沙拉嗪+中藥制劑組(聯(lián)合組)，每組10只。參照文獻(xiàn)[7]制備小鼠結(jié)腸炎模型：給予所有小鼠含3%(w/v)DSS飲水10 d。

1.3 處理方法 自造模后第3天開始給予干預(yù)因素：中藥組給予中藥制劑0.2 mL/10 g體重灌胃；美沙拉嗪組給予美沙拉嗪7.4 mg/(kg·d)灌胃[8]；聯(lián)合組給予同劑量的美沙拉嗪和中藥制劑灌胃；模型組給予同劑量的生理鹽水灌胃。

1.4 觀察內(nèi)容

1.4.1 疾病活動(dòng)指數(shù) 每日觀察小鼠精神狀態(tài)，大便性狀及體重變化。于第10天記錄小鼠大便性狀，收集小鼠糞便行隱血測(cè)定，稱重計(jì)算小鼠體重變化百分?jǐn)?shù)，按表1計(jì)算所有疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index，DAI)。DAI=(體重下降指數(shù)+大便性狀指數(shù)+便血指數(shù))÷3。

1.4.2 髓過(guò)氧化物酶活力 10 d后斷頸處死所有小鼠，剖取結(jié)腸組織，沖洗干凈后，稱取0.2 mg充分研磨后按說(shuō)明書測(cè)定小鼠結(jié)腸髓過(guò)氧化物酶(MPO)活力。

表1 DAI評(píng)分

1.4.3 組織學(xué)評(píng)分 斷頸處死小鼠后，剖取結(jié)腸組織，取病變嚴(yán)重處用生理鹽水沖洗干凈，10%甲醛固定24 h后脫水、石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，蘇木素-伊紅染色。在顯微鏡下觀察，參照文獻(xiàn)[9]并稍做改動(dòng)，制定組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①炎癥：無(wú)：0分，輕度：1分，中度：2度，重度：3分；②杯狀細(xì)胞：未見消失：0分，消失：1分；③病變深度：無(wú)：0分，粘膜下層：1分，肌層：2分，漿膜層：3分；④潰瘍：無(wú)：0分，糜爛：1分，潰瘍：2分；⑤隱窩膿腫：無(wú)：0分，有：1分。

2 結(jié)果

2.1 造模后DAI比較 小鼠在造模后第3～4天開始出現(xiàn)懶動(dòng)、稀便、粘液血便，伴有體重下降。美沙拉嗪和聯(lián)合組小鼠的癥狀明顯改善，體重改變較小，聯(lián)合組的癥狀改善更明顯。于第10天計(jì)算4組小鼠的DAI，模型組小鼠的DAI高于其他3個(gè)治療組(P=0.00)。聯(lián)合組的DAI較美沙拉嗪治療組降低(P<0.01)。見表2。

2.2 各組髓過(guò)氧化物酶(MPO)活力比較 3個(gè)治療組的MPO活力均較模型組明顯改善(P=0.00)，聯(lián)合組比美沙拉嗪組改善更明顯(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 組織學(xué)評(píng)分 結(jié)腸炎模型小鼠腸粘膜連續(xù)性消失，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞消失，隱窩膿腫及潰瘍形成。治療組小鼠腸粘膜炎癥較輕，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，沒(méi)有明顯的隱窩膿腫(見圖1)。模型組小鼠的組織學(xué)評(píng)分為7.21±1.23，3個(gè)治療組評(píng)分較模型組均有所改善(F=19.75，P=0.00)。聯(lián)合組的組織學(xué)評(píng)分較美沙拉嗪組明顯減低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 各組DAI、MPO、組織學(xué)評(píng)分對(duì)比

注：與模型組比較，*P<0.01；與美沙拉嗪組比較，#P<0.01

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種非特異性炎癥性疾病，西醫(yī)藥物治療的目的主要是誘導(dǎo)并維持緩解，但粘液血便反復(fù)發(fā)作使得該病的治療效果較差[10]。美沙拉嗪是治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)典藥物，其療效確切，不良反應(yīng)少，服用方便[11-13]。但由于藥物依賴性、長(zhǎng)期服用的耐藥性與不良反應(yīng)及對(duì)患者的經(jīng)濟(jì)壓力，限制了其在臨床的廣泛使用。

圖1 小鼠結(jié)腸HE染色(×200)

中醫(yī)學(xué)將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“泄瀉”、“痢疾”、“腸癖”等范疇，定為濕熱內(nèi)蘊(yùn)型、氣滯血瘀型、脾胃虛弱型和陰血虧虛型4型，其治療多選擇清熱解毒、涼血止痢、活血化瘀、行氣止痛等組方，可口服，亦可保留灌腸[14]。本研究的中藥組方包括黃連、白頭翁、石榴皮、五倍子等。其中，黃連和白頭翁為千古名方“白頭翁湯”之君藥，為治泄痢之要藥和良藥。胡屹屹等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，白頭翁湯能明顯抑制LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種炎性因子，抑制凋亡基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞能量代謝。方中黃連對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、原蟲及各型流感病毒、真菌類等均有一定的抑制作用[17]。胡淑平等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃連素能顯著抑制小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6及COX-2蛋白、mRNA的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。石榴皮和五倍子酸澀收斂，入大腸經(jīng)，能澀腸止泄痢，為治療久瀉久痢之常用藥，故該組方可以顯著改善結(jié)腸炎癥狀。

本研究結(jié)果表明，中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪能夠明顯改善DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，減輕結(jié)腸組織的充血出血、水腫、潰瘍和炎癥反應(yīng)，推測(cè)與復(fù)方中藥抗炎、抑制炎癥反應(yīng)及廣譜抗菌藥物等有關(guān)，提示復(fù)方中藥制劑聯(lián)合美沙拉嗪治療潰瘍性結(jié)腸炎可通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)減輕病情，效果優(yōu)于單用美沙拉嗪治療。

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Therapeutic effect of traditional Chinese medicine combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice

YU Yi-han,YANG Jian-mei,ZHAO Li,XU Sha,WANG Yi*

(Department of Digestive Internal Medicine,Hubei Xinhua Hospital,Wuhan 430015,China)

Objective To investigate the therapeutic effect of traditional Chinese medicine(TCM)combined with mesalazine on DSS-induced colitis in mice.Methods C57BL/6 mice were used as research subjects and were given water containing dextran sulfate sodium(DSS)to establish the model of colitis.They were randomly divided into four groups,mice in model group,TCM group,mesalazine group,TCM combined mesalazine group(combined group)were given normal saline,TCM,mesalazine,TCM combined with mesalazine by gavage administration from the fourth day respectively.The mental state,defecate traits and changes of body weight were observed every day.The disease activity index(DAI) was calculated.All the mice were sacrificed on the 10th day,and the inflammation degree of colon was assessed by HE dyeing as well as myeloperoxidase(MPO)activity assay.Results Colitis models of mice were established successfully.Compared with model group,DAI,MPO activity,microscopic inflammation score in treatment groups were improved significantly,and the levels in combined group were lower than those of mesalazine group.Conclusion The combined treatment of traditional Chinese medicine and mesalazine can improve not only the symptom score,but also the microscopic inflammation score in colitis mice induced by DSS.

Traditional Chinese medicine;Mesalazine;Colitis;Dextran sulfate sodium

2014-12-09

湖北省新華醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430015

湖北省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(XF2012-30)

10.14053/j.cnki.ppcr.201506002

*通信作者