★ 陳艷劉順國肖雪劉明穎高建勝龍曉英（.廣東藥學(xué)院 廣州50006；.廣州白云山明興制藥有限公司 廣州5050；3.中山大學(xué)南沙研究院 廣州5458）

近紅外光譜法測(cè)定銀黃混合液終點(diǎn)黃芩苷和綠原酸含量*

★ 陳艷1**劉順國2肖雪1,3***劉明穎2高建勝2龍曉英1（1.廣東藥學(xué)院 廣州510006；2.廣州白云山明興制藥有限公司 廣州510250；3.中山大學(xué)南沙研究院 廣州511458）

目的：建立銀黃混合液終點(diǎn)的近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIR）校正模型，探討NIR快速測(cè)定黃芩苷和綠原酸含量的方法。方法：采用多種光譜預(yù)處理方法、波長選擇方法結(jié)合偏最小二乘法對(duì)銀黃混合液的光譜圖與黃芩苷、綠原酸的含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)擬合，并通過交互檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SECV）、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差（SEC）和決定系數(shù)（R2）及優(yōu)選校正模型。結(jié)果：建立的黃芩苷、綠原酸的NIR校正模型的預(yù)測(cè)能力較好。結(jié)論：NIR技術(shù)可以用于銀黃混合液終點(diǎn)階段的黃芩苷、綠原酸含量。

清開靈注射液；銀黃混合液；近紅外光譜；在線檢測(cè)

清開靈注射液是由黃芩苷、金銀花等藥材經(jīng)過現(xiàn)代生產(chǎn)工藝制備而成，主要功效為清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用[1]。但是清開靈注射液生產(chǎn)工藝復(fù)雜，步驟繁多，尤其是液體配制環(huán)節(jié)眾多，對(duì)清開靈注射液的產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的影響[2-4]。清開靈注射液生產(chǎn)過程中有一關(guān)鍵的混合配制工藝即金銀花提取液和黃芩苷的混合，混合配制的結(jié)果直接影響到后續(xù)的生產(chǎn)工藝。該過程目前尚沒有良好的檢測(cè)手段進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，均需要等到混合配制完畢后取樣進(jìn)行常規(guī)理化分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、結(jié)果滯后，不利于生產(chǎn)的快速放行，不適合中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)的需要。近紅外光譜技術(shù)（near infrared spectroscopy，NIRS）是近些年來發(fā)展較快的一種過程分析技術(shù)，其具有分析快速、多指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定、樣品基本不需要前處理等多種優(yōu)點(diǎn)[5-8]。本研究擬采用NIRS技術(shù)對(duì)銀黃混合配制過程的終點(diǎn)進(jìn)行在線監(jiān)控研究，提高生產(chǎn)效率。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Antaris II型傅立葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，配鹵鎢燈，InGaAs檢測(cè)器）；清華大學(xué)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)THUNIR V3.0；W aters2695高效液相色譜儀（美國W aters科技有限公司）；CPA-224S型電子天平（德國Sartorius集團(tuán)）；Synergy UV水純化系統(tǒng)（美國Merck M illipore公司）。

1.2 試劑與樣品 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-2011 17）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-200413）均采購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（Merck公司）；甲酸、磷酸均為分析純（北京現(xiàn)代東方精細(xì)化工有限公司）；超純水自制；其余試劑均為分析純。銀黃混合配制液樣品（廣州白云山明興制藥有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 指標(biāo)成分的測(cè)定 參照2010年版《中國藥典》規(guī)定的方法和清開靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2012年版）對(duì)銀黃混合液中有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2 銀黃混合液的制備及取樣 在銀黃混合罐內(nèi)預(yù)先放入黃芩苷粉末，逐漸流加金銀花提取液并同時(shí)攪拌，自流加完畢，混合數(shù)分鐘后，開始混合過程的取樣。在銀黃混合罐罐體設(shè)置一個(gè)取樣窗口，實(shí)時(shí)采集混合配制過程中的銀黃混合液樣品。

2.3 近紅外光譜掃描 采用近紅外光譜透射探頭插入銀黃混合罐內(nèi)，探頭置于液面1/3下。采集不同批次的透射光譜圖，光譜掃描范圍10 000～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為8 cm-1，液體樣品池為2mm光程的石英比色皿，實(shí)驗(yàn)采用空氣為參比進(jìn)行光譜掃描，測(cè)量時(shí)溫度為25℃，濕度為50%。

2.4 數(shù)據(jù)處理[9-12]將樣品分為校正集、檢驗(yàn)集及外部預(yù)測(cè)集。

采用多種預(yù)處理方法如無預(yù)處理、卷積平滑、卷積求導(dǎo)、多元散色校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換和歸一化中的一種或幾種對(duì)光譜進(jìn)行優(yōu)化。采用多種波長選擇方法如全波長法、相關(guān)系數(shù)法、迭代優(yōu)化等對(duì)光譜進(jìn)行波長選擇。采用偏最小二乘法對(duì)樣品的光譜數(shù)據(jù)與其性質(zhì)含量值做回歸擬合計(jì)算，建立校正模型。

2.5 模型評(píng)價(jià)參數(shù) 采用交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard error of crossvalidation，SECV）、校正標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard error of calibration，SEC）、主因子數(shù)（numbersof latent variable，LV）、決定系數(shù)（coefficient of determ ination，R2）等作為模型的評(píng)價(jià)參數(shù)。通過SECV和SEC優(yōu)選出每種不同波長選擇方法下的模型，然后以LV和R2做比較優(yōu)選最佳模型。

3 結(jié)果與應(yīng)用

3.1 銀黃混合液中主要指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果按照“2.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定銀黃混合液樣品中的主要指標(biāo)成分黃芩苷、綠原酸的含量，結(jié)果如表1所示。

3.2 校正模型的建立與選擇

3.2.1 樣品光譜圖的采集與預(yù)處理 按照“2.3”項(xiàng)的方法對(duì)“2.2”項(xiàng)中采集的銀黃混合液進(jìn)行光譜采集，如圖1A所示。

表1 銀黃混合液中黃芩苷、綠原酸含量 mg·mL-1

圖1 銀黃混合液近紅外光譜圖

表2 黃芩苷校正模型的優(yōu)選

表3 綠原酸校正模型的優(yōu)選

圖2 黃芩苷校正模型參數(shù)圖

3.2.2 校正模型的建立 按照“2.4”項(xiàng)下的預(yù)處理方法對(duì)“3.2.1”項(xiàng)下采集到樣品光譜圖進(jìn)行預(yù)處理，如圖1B-I所示。

按照“2.4”項(xiàng)下的波長選擇方法對(duì)“3.2.1”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理后的光譜圖與“3.1”項(xiàng)下測(cè)定的黃芩苷、綠原酸含量通過PLS進(jìn)行擬合回歸，建立多個(gè)校正模型，結(jié)果如表2和表3所示。

3.2.3 校正模型的主要參數(shù) 通過表2和表3，對(duì)比各個(gè)模型的具體參數(shù)，如LV、SEC、SECV等，最終選擇的校正模型為：（1）黃芩苷，光譜范圍為5804.685~ 6402.509 cm-1，光譜預(yù)處理方法為歸一化，主因子數(shù)為4，得到SEC為0.6945，SECV為0.9950，R2為0.9985；（2）綠原酸，光譜范圍為5793.114~6387.082 cm-1和7586.588~8180.556 cm-1，光譜預(yù)處理方法為卷積平滑，主因子數(shù)為4，得到SEC為0.0014，SECV為0.0019，R2為0.9997。

圖2和圖3分別為黃芩苷和綠原酸校正模型的參數(shù)圖。從圖可以看出，黃芩苷和綠原酸的校正模型均較好，可用于檢驗(yàn)集的數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)。

3.2.4 校正模型的檢驗(yàn) 將“3.2.3”項(xiàng)下選擇好的校正模型，預(yù)測(cè)驗(yàn)證集中的8個(gè)樣品，其結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，銀黃混合液中的黃

圖3 綠原酸校正模型參數(shù)圖

表4 銀黃混合液驗(yàn)證集結(jié)果分析 mg·mL－1

圖4 銀黃混合液校正模型的在線檢驗(yàn)（A.黃芩苷；B.綠原酸）

芩苷和綠原酸含量預(yù)測(cè)均較準(zhǔn)確，偏差較小，均在可接受的誤差范圍內(nèi)。該模型可以用于實(shí)際生產(chǎn)過程中銀黃混合液的在線檢測(cè)。

3.3 校正模型的應(yīng)用 將經(jīng)過檢驗(yàn)的銀黃混合液的校正模型，導(dǎo)入清開靈注射液生產(chǎn)在線監(jiān)控系統(tǒng)，在線檢測(cè)銀黃混合液中的黃芩苷和綠原酸的含量，如圖4所示。

4 討論

銀黃混合配制階段是清開靈注射液生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵配制工藝點(diǎn)，其混合效果的結(jié)果直接影響了后續(xù)工段的順利開展。本試驗(yàn)采用了近紅外光譜技術(shù)對(duì)銀黃配混階段混合終點(diǎn)的主要成分黃芩苷、綠原酸進(jìn)行了快速的含量測(cè)定，預(yù)測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果基本一致。在線近紅外光譜技術(shù)可以推廣應(yīng)用于中藥注射液的生產(chǎn)過程，給其生產(chǎn)帶來巨大的便利，有效的控制生產(chǎn)過程中的質(zhì)量參數(shù)。

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Rapid Determ ination of Baicalin and Chlorogenic Acid of Ying-huang M ixture by Near Infrared Spectroscopy

CHEN Yan1,LIU Shun-guo2,XIAO Xue1,3,LIU M ing-ying2,GAO Jian-sheng2,LONG Xiao-ying1
1.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;
2.Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.Ltd.,Guangzhou 510250,China;
3.Nansha Research Institute,Sun Yat-sen University Guangzhou 511458,China.

Objective:To establish amixed calibration model to determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yinhuangmixing process by near infrared spectroscopy（NIR）.Methods:A variety of spectroscopy pretreatmentmethods and several wavelength selection methods combined the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yinhuang mixture were used to build the calibration models by partial least squares regression,and the standard error of cross validation,the standard error of calibration and the coefficient of determination were used to evaluate themodels.Results:The predictive ability of the models was good as referencemethod.Conclusion:NIR can be used to rapidly determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yin-Huangmixing process.

Qingkailing Injection;Yin-Huang Mixture;Near Infrared Spectroscopy;Online

R284.1

A

2014-08-04）編輯：曾文雪

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2011ZX 09201-201）。

**第一作者：陳艷（1989-），女。研究方向：中藥制劑與開發(fā)。E-mail：994605413@qq.com。

***通信作者：肖雪，博士。研究方向：中藥質(zhì)量分析與生產(chǎn)過程智能控制。E-mail：erxiaohappy@163.com。