★ 程研閔會(huì)何厚洪胡江寧吳健王小東王如偉（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州1005；.浙江康恩貝藥品研究開(kāi)發(fā)有限公司 杭州 1005；.大興安嶺地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所 黑龍江鶴崗 165000；4.浙江康恩貝制藥股份有限公司（浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室） 杭州 1005）

紫外分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪總黃酮的含量*

★ 程研1**閔會(huì)2何厚洪2胡江寧2吳健2王小東3王如偉1,4***（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州310053；2.浙江康恩貝藥品研究開(kāi)發(fā)有限公司 杭州 310052；3.大興安嶺地區(qū)食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所 黑龍江鶴崗 165000；4.浙江康恩貝制藥股份有限公司（浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室） 杭州 310052）

目的：建立黃芪中總黃酮的含量測(cè)定方法，比較不同產(chǎn)地黃芪藥材總黃酮的含量。方法：以毛蕊異黃酮苷為對(duì)照品，采用紫外分光光度法，測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm，對(duì)不同產(chǎn)地黃芪藥材總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：毛蕊異黃酮苷在4～20μg/m L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.9999，平均回收率為99.96%，RSD%為1.53%；不同產(chǎn)地黃芪藥材，總黃酮含量在0.234%～0.383%范圍內(nèi)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的方法適用于測(cè)定黃芪藥材中總黃酮的含量；不同產(chǎn)地黃芪中總黃酮含量以毛蕊異黃酮苷計(jì)由高到低依次為大興安嶺、甘肅、山西、內(nèi)蒙古。

紫外分光光度法；毛蕊異黃酮苷；總黃酮；含量測(cè)定

黃芪為豆科植物蒙古黃芪AstragaLus membranaceus（F isch.）B g e.v a r.m on g ho L icus（B g e.）H si a o或陽(yáng)、利水消腫之功效[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類(lèi)成分為黃芪抗腫瘤的有效成分之一[6]，王光忠[7]、陳鑫[8]、李春紅[9]等分別以蘆丁為對(duì)照，對(duì)黃芪中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定。郭帥等[10]在研究黃酮純化工藝時(shí)則以毛蕊異黃酮苷為對(duì)照，對(duì)總黃酮進(jìn)行測(cè)定。但通過(guò)楊范莉[11]、馮祖飛[12]、梁瑾[13]等對(duì)黃芪藥材中黃酮類(lèi)成分的研究表明，其黃酮類(lèi)成分中以毛蕊異黃酮苷的含量最高。因此作者選擇以毛蕊異黃酮苷為對(duì)照，對(duì)黃芪藥材中總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，測(cè)定結(jié)果真實(shí)、可靠，可以為黃芪藥材中黃酮類(lèi)成分深入研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2450型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；AgiLent1200高效液相色譜儀（AgiLent公司）；BS210S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；AX 205電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；HWS26型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料與試藥 山西、內(nèi)蒙古、甘肅及大興安嶺黃芪藥材（購(gòu)自磐安康恩貝藥材發(fā)展有限公司）；毛蕊異黃酮苷（純度≥99%，批號(hào)：130312，上海盛中醫(yī)藥化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1m L含0.5052m g的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 分別取樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱(chēng)定，置茄形瓶中，精密加入70%乙醇50m L，加熱回流3 h，濾過(guò)，濾液合并，濃縮至近干。加10m L水使溶解，轉(zhuǎn)移至60m L分液漏斗中，加水飽和正丁醇振搖提取3次，每次25m L，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得各樣品的供試品溶液。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0m L，分別置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，在900～190 n m波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶均在260 n m處有特征吸收峰。

2.4 測(cè)定法 精密量取供試品溶液1.0m L，置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在260 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液0.2, 0.4，0.6，0.8，1.0m L，分別置25m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光膜莢黃芪AstragaLusmembranaceus（F isch.）B g e.的干燥根[1]，主要含有黃酮、皂苷、多糖等[2-4]，具有補(bǔ)氣升光度法，在260 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（X）為縱坐標(biāo)，濃度（Y）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=55.897X-0.0007,r=0.9999，說(shuō)明毛蕊異黃酮苷在4～20μg/m L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液1份，稀釋25倍，于260 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)定吸光度6次，RSD為0.57%，精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，稀釋25倍，分別在0，1，2，4，6，24 h測(cè)定吸光度，RSD為4.95%，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份黃芪粗粉，精密稱(chēng)定，參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項(xiàng)下測(cè)定法測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果RSD為1.41%，符合要求。

2.6.4 回收率試驗(yàn) 取黃芪粗粉約0.25 g共6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入1m L毛蕊異黃酮苷對(duì)照品溶液（0.776mg/m L），精密加入70%乙醇50m L，搖勻，參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項(xiàng)下測(cè)定法測(cè)定并計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果加樣回收率為97.39%～101.50%，平均為99.96%，RSD為1.53%。

表1 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量（n=10）

2.7 樣品的含量測(cè)定 參照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，參照“2.4”項(xiàng)下測(cè)定法測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量（表1）。

以毛蕊異黃酮苷計(jì)，不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量大小依次為大興安嶺＞甘肅＞山西＞內(nèi)蒙。其中，大興安嶺地區(qū)黃芪藥材中總黃酮含量普遍較高。但總體上看，各地黃芪藥材中總黃酮含量相差不大。

3 討論

3.1 對(duì)照品的選擇 國(guó)內(nèi)多以蘆丁為對(duì)照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定黃芪藥材中總黃酮的含量[14-16]。作者參照《中國(guó)藥典》中蘆丁的含量測(cè)定方法，利用HPLC法測(cè)定黃芪藥材中蘆丁和毛蕊異黃酮苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供試品溶液的色譜圖中未檢測(cè)出明顯的蘆丁色譜峰，并且，通過(guò)計(jì)算得出藥材中毛蕊異黃酮苷的含量為0.07%，約占總黃酮的20%，是黃芪藥材中最主要的異黃酮類(lèi)成分。汪德清等報(bào)道黃芪總黃酮中，異黃酮類(lèi)化合物占74%[17]。《中國(guó)藥典》黃芪項(xiàng)下亦確定毛蕊異黃酮苷作為藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，因此作者選擇以毛蕊異黃酮苷作對(duì)照，建立黃芪藥材中總黃酮含量的測(cè)定方法。

3.2 供試品溶液制備的前處理過(guò)程篩選 南換杰[18]通過(guò)石油醚脫脂-乙醇提取，測(cè)定黃芪中總黃酮的含量。朱正蘭[15]在石油醚脫脂-乙醇提取的基礎(chǔ)上，增加了乙酸乙酯萃取的步驟，操作過(guò)程較為繁瑣。作者試驗(yàn)過(guò)直接采用乙醇提取，以毛蕊異黃酮苷為對(duì)照品來(lái)測(cè)定黃芪中總黃酮的含量，但全波長(zhǎng)掃描結(jié)果中未檢測(cè)出最大吸收波長(zhǎng)。參考朱正蘭的樣品前處理方法，采用70%乙醇提取、乙酸乙酯萃取的方法來(lái)制備供試品溶液，節(jié)省了樣品前處理時(shí)間。之后，作者測(cè)定了轉(zhuǎn)移后的溶液分別經(jīng)乙酸乙酯萃取和水飽和正丁醇萃取后的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品溶液經(jīng)水飽和正丁醇萃取后測(cè)得含量更高，通過(guò)H P L C法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)供試品溶液經(jīng)水飽和正丁醇萃取后在254 n m下有紫外吸收的物質(zhì)并未減少，而E L SD檢測(cè)器檢測(cè)到黃芪中部分物質(zhì)被除去，因此我們確定了70%乙醇提取、水飽和正丁醇萃取測(cè)定黃芪中總黃酮含量的測(cè)定方法，可用于快速測(cè)定黃芪中總黃酮的含量。

3.3 不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量測(cè)定 由測(cè)定結(jié)果可以看出，大興安嶺產(chǎn)黃芪藥材中總黃酮含量相對(duì)最高，且不同批次間相對(duì)穩(wěn)定（含量為0.354%～0.383%），甘肅、山西產(chǎn)黃芪中總黃酮含量次之，內(nèi)蒙古產(chǎn)黃芪藥材中總黃酮含量最低。但總體來(lái)看，四個(gè)產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮的含量差別不大。

上述試驗(yàn)建立的以毛蕊異黃酮苷為對(duì)照品，測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪藥材中總黃酮含量的方法操作簡(jiǎn)單、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于黃芪藥材中總黃酮的含量測(cè)定和黃芪藥材的質(zhì)量控制。

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Determ ination of Flavonoid in AstragaLus Grown in Different Areas by UV Spectrophotometry

CHENG Yan1,M IN Hui2,HE Hou-hong2,HU Jiang-ning2,WU Jian2,WANG Xiao-dong3,WANG Ru-wei1,4
1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China；
2.Zhejiang Conba Drug Research and Development CO.,LTD.,Hangzhou 310052,China；
3.Daxing'anling Food and Drug Inspection Institute,Hegang 165000,China；
4.Zhejiang Conba Pharmaceutiacl CO.LTD.（Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology）,Hangzhou 310052,China.

Objective:To establish a new method for determining the contents of flavonoid in AstragaLus among different areas.Methods:Flavonoid in AstragaLuswas determined by UV spectrophotometry at the wavelength 260 nm,with calycosin-7-glucoside as index.And thismethod can be used for assaying of flavonoid in AstragaLus from different habitats.Results:The linear range of calibration curve was 4～20μg/mL,r=0.9999.The average recovery rate was 99.96%with the relative standard deviation 1.53%.The contents of flavonoid in AstragaLus were 0.234%～0.383%.Conclusion:Thismethod can be used for evaluation of quality of flavonoid in AstragaLus.The contents in flavonoid can be ranked as follows:Daxinganling>Gansu>Shanxi>Neimenggu.

UV Spectrophotometry;calycosin-7-glucoside;flavonoid;quantitativ-e determination

R284.1

A

2014-09-29）編輯：曾文雪

浙江省企業(yè)研究院項(xiàng)目（2010E90011）。

**第一作者：程研（1990-），女，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制。E-mail：18958046151@163.com。

***通信作者：王如偉，男，博士生導(dǎo)師。Tel:（0571）87774766，E-mai:wangrw@conbagroup.com。