朱登峰 姜波健 費哲為 朱松明 陳峰

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·論 著·(臨床研究)

Twist介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子在胃癌組織中的表達

朱登峰 姜波健 費哲為 朱松明 陳峰

目的 檢測Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌中的表達和臨床意義，探討Twist介導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。方法 采用免疫組織化學技術(shù)分別檢測Twist、E-cadherin及N-cadherin在108例胃癌原發(fā)灶及相應(yīng)的癌旁組織中的表達，統(tǒng)計分析Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌原發(fā)灶表達強度的相關(guān)性及與胃癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 ①Twist和N-cadherin在胃癌中的表達率分別顯著高于相應(yīng)癌旁組織(53.7%比38.0%，P=0.020；55.6%比33.3%，P=0.001)；E-cadherin在胃癌中的表達率顯著低于相應(yīng)的癌旁組織(41.7%比71.3%，P<0.001)。② 胃癌原發(fā)灶中Twist、E-cadherin及N-cadherin的表達高低分別與T分期(P<0.001；P=0.005；P<0.001)、TNM分期(P=0.005;P=0.029;P=0.016)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005;P=0.001；P=0.002)有關(guān)。③在胃癌原發(fā)灶中，Twist的表達與N-cadherin的表達呈正相關(guān)(r=0.365，P<0.001)；Twist的表達與E-cadherin的表達呈負相關(guān)(r=-0.232,P=0.016)。④ Logistic回歸分析提示Twist(P<0.001)和N-cadherin(P<0.001)陽性表達分別是T分期的獨立危險因素；E-cadherin陰性表達是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素(P=0.001)。Cox風險回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)及Twist陽性表達(P=0.005)是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨立因素。結(jié)論 在胃癌組織中，Twist表達和N-cadherin表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，Twist介導的EMT可能與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

胃癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Twist；E-cadherin；N-cadherin

胃癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第5位[1]，死亡率居第3位[2]。在我國，胃癌新發(fā)病例約48.57人/10000人/年，死亡約35.60人/10000人/年[3]。腫瘤的復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移是導致胃癌死亡的主要原因，但其發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制尚不完全清楚。近年來國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子Twist作為EMT的關(guān)鍵調(diào)控因子，在EMT發(fā)生過程中扮演重要角色[4]。EMT最重要的變化是上皮細胞形態(tài)的改變和極性的喪失，轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎g黏附力低，而遷移能力、侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力強的間質(zhì)細胞的特性，從而成為腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用免疫組織化學染色方法檢測人胃癌原發(fā)病灶中和癌旁組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin的表達，進而探討Twist介導的EMT與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、病例資料和組織樣本來源

經(jīng)倫理委員審批后同意，選取上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院2010年1月至2013年1月期間收治的108例經(jīng)病理檢驗確診為胃腺癌的病人作為研究對象，男性73例，女性35例；年齡36～83歲，中位年齡58歲；均行D2胃癌根治術(shù)(R0)。新鮮標本取自切除的胃癌原發(fā)灶或配對的距原發(fā)灶邊緣5 cm以上并獲得病理學檢查證實的正常胃黏膜組織。術(shù)中嚴格遵守無瘤原則，避免擠壓。所有病人術(shù)前均未行放療或化療。所有入組病例均經(jīng)病人或其家屬知情同意。生存隨訪截止時間為2015年4月，均采用電話或門診隨訪，隨訪率為85%。

二、方法

1.主要試劑 小鼠抗人Twist單克隆抗體購自美國Abcam公司、兔抗人E-cadherin單克隆抗體和兔抗人N-cadherin單克隆抗體購自美國CST公司。SABC免疫組織化學試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒購自武漢博士德公司。PBS緩沖液(pH7.4)、二甲苯、枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液、多濃度梯度酒精、過氧化氫等試劑均為上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院病理科提供。

2.免疫組織化學染色 Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白檢測：所有標本經(jīng)甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，以4 μm為厚度，將石蠟包塊連續(xù)切片。采用SABC法行免疫組織化學染色，染色步驟按試劑盒說明書進行。所有切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。0.3%過氧化氫溶液浸泡處理，蒸餾水沖洗后置入枸櫞酸鈉緩沖液中，采用微波加熱法抗原修復(fù)。隨后PBS沖洗3次，滴加5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，室溫30 min后，甩去多余液體，不沖洗。滴加一抗(稀釋濃度為Twist為1∶200，E-cadherin為1∶400，N-cadherin為1∶200)后，4℃孵育過夜。PBS沖洗后滴加生物素化二抗，室溫孵育30 min。PBS沖洗后，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)，室溫孵育30 min，PBS沖洗后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。DAB顯色后，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化。最后脫水、烘干、封片和鏡檢。以PBS替代一抗作為陰性對照，以試劑公司提供的已知陽性切片為陽性對照。

3.免疫組織化學染色評分 切片經(jīng)兩名病理科醫(yī)生在未知臨床病例資料情況下顯微鏡閱片評分，并協(xié)商取得統(tǒng)一。評分標準如下：①染色強度判定：無陽性染色為0分；淺黃色染色為1分；介于淺黃色和深黃色之間染色為2分；深黃色或棕黃色染色為3分。②陽性細胞數(shù)比率判定：無細胞陽性著色為0分；1%～25%的細胞陽性著色為1分；26%～50%的細胞陽性著色為2分；51%～75%的細胞陽性著色為3分；大于75%的細胞陽性著色為4分。最終以染色的評分和染色細胞所占比率的評分乘積作為每張切片的最終染色評分。0～3分視為陰性，> 3分視為陽性。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS(17.0版)軟件行統(tǒng)計學處理。胃癌原發(fā)灶與癌旁組織中蛋白的表達差異性及胃癌原發(fā)灶中的蛋白表達與胃癌臨床病例特征間的關(guān)系采用Chi-square檢驗。Logistic回歸分析用于多因素分析。兩種蛋白之間表達的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法用于生存單因素分析，Cox模型用于生存多因素分析。

結(jié) 果

一、胃癌組織和癌旁組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達的比較

免疫組織化學染色顯示，Twist和N-cadherin在胃癌組織中均有廣泛表達，而E-cadherin在癌旁組織中廣泛表達(圖1)。108例胃癌組織標本中Twist表達率為53.7%(58/108)，高于癌旁組織中的表達38.0%(41/108) (P=0.020)。E-cadherin在胃癌組織中的表達率為41.7%(45/108)，明顯低于癌旁組織中的表達71.3%(77/108) (P<0.001)。N-cadherin在胃癌組織中的表達率為55.6%(60/108)，高于癌旁組織中的表達33.3%(36/108) (P=0.001)(表1)。

二、胃癌組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達與胃癌病人臨床病理特征間的關(guān)系

Twist和N-cadherin在T3+T4期(T分期)、Ⅲ+Ⅳ期(TNM分期)及N1+N2+N3期(N分期)胃癌中的表達明顯高于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相反，E-cadherin在T3+T4期、Ⅲ+Ⅳ期及N1+N2+N3期胃癌中的表達明顯低于T1+T2期、Ⅰ+Ⅱ期及N0期胃癌中的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是，Twist、E-cadherin及N-cadherin在胃癌組織中的表達與胃癌病人年齡、性別、腫瘤直徑、Lauren分型、血管浸潤和淋巴管浸潤等因素無關(guān)(P>0.05)(表2)。

胃癌組織中Twist、N-cadherin及E-cadherin表達的Logistic回歸分析提示，Twist和N-cadherin陽性表達是影響腫瘤浸潤(T分期)的獨立危險因素(TwistP< 0.001, N-cadherinP<0.001)。E-cadherin陰性表達是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素(P=0.001)。

三、胃癌組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析顯示，Twist與E-cadherin在胃癌組織中的表達呈負相關(guān)(r=-0.232，P=0.016)；Twist與N-cadherin在癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.365，P<0.001)(表3)。

四、生存分析

Kaplan-Meier法生存分析顯示Twist和N-cadherin陽性組生存時間小于陰性組生存時間，而E-cadherin陽性組生存時間大于陰性組生存時間，經(jīng)Log-rank法檢驗各組生存時間具有統(tǒng)計學意義(TwistP<0.001，N-cadherinP=0.002，E-cadherinP<0.001)(圖2)。

Cox風險回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.029)及Twist陽性表達(P=0.005)是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨立因素(表4)。

表1 胃癌組織(n=108)和癌旁組織(n=108)中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達(Chi-square test) [例(%)]

表2 胃癌組織中Twist、E-cadherin和N-cadherin的表達與胃癌病人臨床病理特征間的關(guān)系(例)

表3 Twist、E-cadherin和N-cadherin在胃癌組織中表達強度的相關(guān)性(例)

討 論

胃癌嚴重危害人類健康，盡管胃癌的早期診斷、手術(shù)方式及新輔助化療取得了一定的進展，但其5年生存率仍不足30%[5]。造成胃癌病人死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移，大部分進展期胃癌病人因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去根治性手術(shù)的機會，因此探究胃癌轉(zhuǎn)移的機制及尋找胃癌轉(zhuǎn)移的分子標志物對于胃癌的診治顯得尤為重要。

近年來EMT已成為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究熱點。EMT是指上皮細胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞的表型，同時細胞黏附能力降低，運動遷移能力增強。EMT發(fā)生時，上皮細胞標志物E-cadherin及細胞角蛋白等表達降低，間質(zhì)細胞標志物N-cadher-in及Vimentin等表達增高[6]。越來越多的研究證實，EMT有助于癌細胞的遷移、侵襲及擴散，在上皮腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-10]。E-cadherin是保持上皮細胞之間黏附的主要細胞間分子，可抑制細胞的遷移。E-cadherin的表達下調(diào)則降低了細胞之間的黏附力，導致細胞遷移能力增強，成為細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的前提[11-12]。此外，研究顯示E-cadherin在人類多種腫瘤中表達降低[13-14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)E-cadherin在胃癌原發(fā)灶中的表達要低于癌旁組織中的表達，同時與胃癌的T分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，胃癌組織中E-cadherin的低表達可能引起胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

注:A.胃癌組織中Twist呈陽性表達;B.胃癌組織中E-cadherin呈陽性表達;C.胃癌組織中N-cadherin呈陽性表達;D.癌旁正常胃黏膜組織中Twist呈陰性表達;E.癌旁正常胃黏膜組織中E-cadherin呈陽性表達;F.癌旁正常胃黏膜組織中N-cadherin呈陰性表達圖1 胃癌原發(fā)灶及癌旁正常胃黏膜組織中Twist、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達(SABC法,×200)

注:A.Twist陽性表達與Twist陰性表達的比較;B.E-cadherin陽性表達與E-cadherin陰性表達的比較;C.N-cadherin陽性表達與N-cadher-in陰性表達的比較圖2 胃癌原發(fā)灶中Twist、E-cadherin及N-cadherin表達陽性組與陰性表達組胃腺癌病人生存曲線

表4 Cox回歸模型多因素生存分析結(jié)果

Twist是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[15]。Twist與N-cadherin基因第一內(nèi)含子中的E-box原件結(jié)合，誘導N-cadherin轉(zhuǎn)錄[16]。在胃癌研究中，已有報道Twist過表達與N-cadherin表達升高相關(guān)[17]，Twist與胃癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[18]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中Twist的表達明顯高于癌旁組織中的表達，提示Twist在胃癌的發(fā)生中起到一定的作用。同時，胃癌組織中N-cadherin表達高于癌旁組織，并且Twist高表達、N-cadherin高表達、E-cadherin的低表達與胃癌的T分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此我們推斷胃癌組織中Twist表達的升高可在轉(zhuǎn)錄水平抑制E-cadherin表達，誘導N-cadherin表達，促使EMT的發(fā)生，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。此外，Logistic回歸分析提示，胃腺癌原發(fā)灶中Twist陽性表達是T分期的獨立危險因素，Cox風險回歸多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Twist陽性表達是影響胃腺癌病人術(shù)后生存的獨立因素。

綜上所述，Twsit在胃癌中高表達，其表達水平與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Twist可能通過EMT的分子機制參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，Twist可能是調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的一個重要樞紐，對Twist蛋白在癌組織中的表達檢測可能是預(yù)判腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可行方法，并有望成為胃癌靶向治療的靶點，但是對Twist介導的EMT過程還有待于進一步的研究。

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Expression of snail mediated EMT in gastric carcinoma

ZhuDengfeng*，JiangBojian，F(xiàn)eiZhewei，ZhuSongming，ChenFeng.

*DepartmentofGeneralSurgery，No.3People'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999，China

JiangBojian,Email:Jiang_md@hotmail.com

Objective To observe the clinical significances and the expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin during Twist-mediated epithelial-mesenchymal transition (EMT) in gastric cancer tissues. Methods The expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin were detected by immunohistochemistry in primary cancer tissues and in normal mucosa tissues of 108 patients with gastric cancer. The correlation among expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin in gastric cancer tissues and the clinical pathologic characteristics were further analyzed. Results (1) The positive expression rates of Twist and N-cadherin in gastric cancer tissues were 53.7% and 55.6% respectively, which were higher than those in gastric normal mucosa tissues (38.0% and 33.3%) with significant differences (P=0.020;P=0.001); but lower positive expression rate of E-cadherin in gastric cancer tissues was found (41.7%) compared with those in gastric normal mucosa tissues (71.3%), significant difference could be seen between both groups (P<0.001); (2) The expressions of Twist, E-cadherin and N-cadherin in primary gastric cancer tissues was noted to present tendency correlating with the T stage (P<0.001;P=0.005;P<0.001), pTNM stage (P=0.005;P=0.029;P=0.016) and lymph node metastasis (P=0.005;P=0.001;P=0.002); (3) The expression of Twist was positively seen correlation with that of N-cadherin (r=0.365,P<0.001), and but with that of E-cadherin (r=-0.232,P=0.016) in primary gastric cancer tissues. (4) Logistic regression analysis revealed that T stage was an independent risk factor for positive expression of Twist (P<0.001) or N-cadherin (P<0.001), and that lymph node metastasis was the independent risk factor for negative expression of E-cadherin (P=0.001). Multivariate analysis with the COX regression models showed that expression of Twist (P=0.005) and lymph node metastasis (P=0.029) were significantly correlated with the poor prognosis. Conclusions The expressions of Twist and N-cadherin were up-regulated, whereas the expression of E-cadherin was down-regulated in primary gastric cancer tissues, suggesting Twist-mediated EMT may be involved in the invasion and metastasis of gastric cancer.

Gastric cancer; Epithelial-mesenchymal transition; Twist; E-cadherin; N-cadherin

上海交通大學醫(yī)學院科研基金(13XJ10028)

201999 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬第三人民醫(yī)院普外科(朱登峰、姜波健)；上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院(崇明分院)普外科(費哲為、朱松明、陳峰)

姜波健，Email：Jiang_md@hotmail.com

R735.2

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2015.04.020

2015-05-11)