徐亞娟，高元奇，付丹陽，祁 婧，楊秋野，劉文書

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院）

cks1siRNA對舌癌的細(xì)胞凋亡的影響研究

徐亞娟1，高元奇2，付丹陽3，祁 婧3，楊秋野3，劉文書4＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院）

近年來研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細(xì)胞周期調(diào)控因子的異常而導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂所致，因此，尋找有關(guān)的調(diào)控因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行研究，對腫瘤的治療具有重要的意義［1］。Cks1是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的亞基，它是高度保守的Sucl／cks家族成員，能與其他細(xì)胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2］。本文用RNA干擾抑制CKS1的表達(dá)，觀察其對舌癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響，為其基因治療舌癌提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人舌癌細(xì)胞Tca8113購自北京博楓科生物科技有限公司；培養(yǎng)基采用DMEM（美國，Gibco公司）；10%胎牛血清（以色列）和雙抗，合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意義鏈），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（無關(guān)對照鏈）（上海GenePharma公司）。siRNA序列進(jìn)行2＇Ome修飾（穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu)）和5＇FAM修飾（綠色熒光）。GenePharma siRNAMateTM轉(zhuǎn)染試劑盒。RAPI裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；內(nèi)參抗體GAPDH抗體購自美國Abcame公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌癌細(xì)胞Tca8113采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至90%匯合，0.25%胰酶（含1%EDTA）消化，含血清DMEM終止消化，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，1∶4比例傳代。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于以下試驗。

1.2.2 Cks1siRNA轉(zhuǎn)染 合成Cks1siRNA：5’－UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT－3’（有意義鏈），5’－UUCUUCGAACGUGUCACGUTT－3（無關(guān)對照鏈）siRNA序列進(jìn)行2＇Ome修飾（穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu)）和5＇FAM修飾（綠色熒光）。按GenePharma siRNA－MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒和siRNA－MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒操作。體外培養(yǎng)細(xì)胞至2.5×104個／mL，并提前一天將細(xì)胞接種在24孔板中，待細(xì)胞的匯合度在30%－50%采用siRNA－MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒將CKS1siRNA導(dǎo)入Tca8113細(xì)胞，37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.2.3 western blot檢測轉(zhuǎn)染前后Tca8113細(xì)胞的Cks1蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞，將細(xì)胞分為3組，每組分別為空白組、陰性對照組、siRNATca8113組，每組設(shè)3個復(fù)孔?？瞻捉M的Tca8113細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化Tca8113細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液，以每孔5×103個接種于96孔培養(yǎng)板，補(bǔ)足高糖DMEM培養(yǎng)液至100μl，在CO2孵育箱中37℃、5%CO2以及飽和濕度的條件下，培養(yǎng)24 h；陰性組（與人類基因組序列無同源性）和siRNA組Tca8113細(xì)胞先進(jìn)行CKS1siRNA轉(zhuǎn)染4h，CKS1－siRNA轉(zhuǎn)染濃度為10UM。通過SDSPAGE和western blot對轉(zhuǎn)染前后Tca8113細(xì)胞的Cks1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)染前后Tca8113細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞的培養(yǎng)如上準(zhǔn)備，按操作說明書進(jìn)行Annexin V－FITC和碘化丙啶染色后，采用流式細(xì)胞儀對轉(zhuǎn)染前后Tca8113細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的影響進(jìn)行檢測。檢測細(xì)胞周期百分?jǐn)?shù)、凋亡指數(shù)、增殖指數(shù)作為評估參數(shù)，每組細(xì)胞獲得10個數(shù)值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)通過Excel電子表格輸入計算機(jī)建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行整理，計算出各組各參數(shù)的均值及標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s），作為主要描述性指標(biāo)；方差分析各主要指標(biāo)的差異進(jìn)行比較。全部統(tǒng)計計算應(yīng)用SAS軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染后Tca8113細(xì)胞Cks1蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)Imagej軟件分析圖像灰度值，進(jìn)行半定量分析，各組之間的比值差異2倍以上認(rèn)定為有顯著性差異。如圖1、表1所示，siRNA轉(zhuǎn)染后的Cks1蛋白水平顯著下降，與對照和空白siRNA組比較均有顯著性差異。

圖1 Western blot檢測siRNA對Tca8113細(xì)胞Cks1蛋白水平的影響

表1 CKS1的蛋白表達(dá)水平

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果

見表2。與空白對照比較，陰性轉(zhuǎn)染對照組無明顯變化，轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞比例顯著高于對照（P＜0.05）。

表2 流式檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后Tca8113細(xì)胞的凋亡率的比較（%）

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期的影響結(jié)果

見表3。與空白對照比較，陰性轉(zhuǎn)染對照組無明顯變化，轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞比例顯著增多（P＜0.05）。細(xì)胞周期阻滯于G2期。

表3 轉(zhuǎn)染處理前后Tca8113細(xì)胞的細(xì)胞周期的比較（%）

3 討論

Cks1是高度保守的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Suc1／Cks蛋白家族成員之一。目前已經(jīng)有大量的研究表明Cks1在多種腫瘤的病理組織中（包括胃癌、乳腺癌和直腸癌等）高表達(dá)，并發(fā)揮著一定的生物學(xué)功能［3－5］。

Cks1siRNA在抑制多種腫瘤的表達(dá)中可能發(fā)揮重要作用。Wang等［6］運(yùn)用RNA干擾技術(shù)證實(shí)了干擾Cks1基因能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Tsai等［7］利用RNA小分子干擾實(shí)驗對肺癌和上皮癌進(jìn)行實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞停滯在G2／M期，并且腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了大量的凋亡。但對正常的細(xì)胞無明顯的生長抑制和凋亡的作用，提出Cks1干擾可作為癌癥基因治療的靶點(diǎn)。本實(shí)驗結(jié)果顯示Cks1siRNA成功地干擾了Tca8113細(xì)胞中的cks1蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染組的凋亡細(xì)胞比例顯著高于空白組和陰性轉(zhuǎn)染組對照組（P＜0.05），增加了細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡。轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞比例顯著增多，顯示了轉(zhuǎn)染Cks1siRNA引起細(xì)胞的G2／M阻滯，細(xì)胞能夠復(fù)制DNA，但是不能完成有絲分裂，使得細(xì)胞無法完成復(fù)制，與凋亡檢測結(jié)果吻合。與文獻(xiàn)的報道相一致。Cks1siRNA抑制了Tca8113細(xì)胞阻滯于G2期，增加了細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，研究結(jié)果為Cks1siRNA治療舌癌的進(jìn)一步的實(shí)驗研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

［1］Kratzat S，Nikolova V，Miething C，et al.Cks1is required for tumor cell proliferation but not sufficient to induce hematopoietic malig－nancies［J］.PLoS One，2012，7（5）：e37433.

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2014－08－12）

1007－4287（2015）02－0202－02

吉林省發(fā)展和改革委員會資助（項目編號：JF2012C006－8）

＊通訊作者