吳曉霞,李建科

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

五倍子單寧脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

吳曉霞,李建科*

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

以超聲波輔助溶劑提取法提取五倍子單寧,逆相蒸發(fā)法制備五倍子單寧脂質(zhì)體,研究制備脂質(zhì)體最佳工藝,并對(duì)在優(yōu)化條件下制備的脂質(zhì)體進(jìn)行理化性質(zhì)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明優(yōu)化條件為:卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(SPC/CH)為2∶1、有機(jī)相與水相體積比(O/A)為6∶1、緩沖液pH6.5。在此條件下質(zhì)量濃度為1mg/mL的五倍子單寧溶液制備的五倍子單寧脂質(zhì)體包封率為72.26%。結(jié)構(gòu)描述:有效粒徑為(79.39±11.62)nm,Zeta電位為-44.7mV,穩(wěn)定性:4℃條件下儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好。逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體工藝簡(jiǎn)單可行,包封率高,粒度均勻,穩(wěn)定性好,可用于五倍子單寧脂質(zhì)體的制備。

五倍子單寧,脂質(zhì)體,逆相蒸發(fā)法,質(zhì)量評(píng)價(jià)

五倍子(GallaChinensis),又稱(chēng)文蛤、百蟲(chóng)倉(cāng)、木附子,是由五倍子蚜蟲(chóng)寄生在漆樹(shù)科植物鹽膚木、青麩楊或紅麩楊葉上形成的蟲(chóng)癭[1],又稱(chēng)棓子。在我國(guó),主產(chǎn)區(qū)集中在貴州、四川、湖北、湖南、陜西、云南等六省,這些省份的五倍子產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的90 %以上[2]。五倍子單寧是五倍子的主要功能成分和含量最多的成分,五倍子單寧含量可達(dá)70%以上[3]。按照單寧的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征,單寧可分為如下:可水解單寧,縮合單寧和復(fù)合單寧[4],實(shí)驗(yàn)所用單寧為水解單寧,是由沒(méi)食子酸、雙倍酸與葡萄糖結(jié)合以甙或酯的形式形成的復(fù)雜混合物[5]。五倍子單寧不僅具有抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用,還具有不同程度的抗過(guò)敏、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性[3]。

脂質(zhì)體是磷脂分散在水中自然形成多層囊泡,每層均為雙分子層,囊泡中央和各層之間被水相隔開(kāi)[6]。脂質(zhì)體是由磷脂為膜材料及附加劑組成[7]。脂質(zhì)體具有類(lèi)似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),內(nèi)部含著一定體積的水溶液。脂質(zhì)體的制備方法有很多種,主要有薄膜法、逆相蒸發(fā)法、注入法、凍融法、服乳法、pH梯度法和冷凍干燥法等[8]。逆相蒸發(fā)法適合包裹水溶性藥物、大分子生物活性物質(zhì)如各種抗生素、胰島素、免疫球蛋白、堿性磷脂酶和核酸等。

用脂質(zhì)體包裹藥物可使藥物選擇性地分布于人體內(nèi)某些組織和器官,避免藥物氧化、降解和破壞,可增加藥物通過(guò)細(xì)胞膜的能力,起到增強(qiáng)療效的作用[9]。目前,關(guān)于多酚類(lèi)物質(zhì)制備脂質(zhì)體的研究有石榴皮多酚脂質(zhì)體[10]、茶多酚脂質(zhì)體[10]等的研究,但沒(méi)有關(guān)于五倍子單寧脂質(zhì)體的研究,而五倍子在臨床上有很重要的功效。因此,對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五倍子單寧純化物 實(shí)驗(yàn)室制備;五倍子單寧標(biāo)品、大豆卵磷脂(SPC,soybean phospholipids)、膽固醇(CH,cholesterol) 西安市晶博生物技術(shù)有限公司;氯仿及其余試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

光學(xué)顯微鏡、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1 810) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;超高速低溫離心機(jī)(3k30) 美國(guó)Sigma公司;精密微量移液器(100～1000μL) 德國(guó)Eppendorf;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA) 上海亞榮生化儀器廠;激光粒度和Zeta電位儀(NANO-ZS) 英國(guó)Malvern公司;精密pH計(jì)(PHS-3C):上海精密科學(xué)儀器有限公司;漩渦混合器(XW-80A) 海門(mén)市其林貝爾儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子單寧的提取及純化 為陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室制備[11-12]。

1.2.2 五倍子單寧脂質(zhì)體的制備 參考文獻(xiàn)[13-15]。

1.2.2.1 五倍子單寧磷酸鹽緩沖溶液的配制 稱(chēng)取100mg的五倍子單寧純化物,用pH6.5磷酸緩沖液定容至100mL的棕色容量瓶中,即得質(zhì)量濃度為1mg/mL的五倍子單寧磷酸鹽緩沖溶液[10]。

1.2.2.2 五倍子單寧脂質(zhì)體的制備工藝 采用逆相蒸發(fā)法制備五倍子單寧脂質(zhì)體,研究在大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1;有機(jī)相和水相的體積比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1;磷酸鹽緩沖液的pH4.5、5.5、6.5、7.5、8.5時(shí),以五倍子單寧脂質(zhì)體的包封率為考察指標(biāo)確定最佳制備工藝。

1.2.3 五倍子單寧脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密配制濃度分別為0、10、20、30、40、50μg/mL系列五倍子單寧溶液;以雙蒸水為空白對(duì)照,在最佳波長(zhǎng)處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。以五倍子單寧濃度為橫坐標(biāo),吸光度A值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行回歸分析。

1.2.3.2 五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[16-17]，采用高速冷凍離心法測(cè)定包封率:取五倍子單寧脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體溶液各3mL于離心管中,分別加入乙酸乙酯3mL破乳,旋渦3min;于15000r/min轉(zhuǎn)速、4℃溫度條件下離心30min,取上清液1mL至25mL的容量瓶中,加入蒸餾水定容;空白脂質(zhì)體作為對(duì)照,在最佳波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度;代入回歸方程,得到總量Ct。

取五倍子單寧脂質(zhì)體及空白脂質(zhì)體溶液各3mL于離心管中,直接在15000r/min轉(zhuǎn)速、4℃溫度條件下離心30min,取上清液1mL至25mL的容量瓶中,空白脂質(zhì)體作為對(duì)照,在最佳波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。代入回歸方程,得到未被包入即游離的脂質(zhì)體量Cf。

得到總量和游離脂質(zhì)體量,包封率便可求出:

1.2.4 脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià) 鑒于脂質(zhì)體在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用原理,一般采用3個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的性質(zhì):脂質(zhì)體的大小、包封率和脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[6]。

脂質(zhì)體的大小:采用掃描電鏡、激光散射法或激光掃描法測(cè)定。

包封率(%)=(脂質(zhì)體中包封的藥物/脂質(zhì)體中藥物總量)×100。

脂質(zhì)體穩(wěn)定性:也是衡量脂質(zhì)體特性的主要指標(biāo)之一。它反映了脂質(zhì)體溶液包封率隨時(shí)間變化的情況。主要用滲漏率表示,滲漏率(%)=(放置前介質(zhì)中藥物量-放置后介質(zhì)中的藥量)/制劑中藥量×100。

1.2.4.1 五倍子單寧脂質(zhì)體外觀檢驗(yàn) 光學(xué)顯微鏡下觀察:將五倍子單寧脂質(zhì)體溶液稀釋100倍后,滴1滴于載玻片上,在光學(xué)顯微鏡下觀察脂質(zhì)體外觀形態(tài)并拍照記錄。

1.2.4.2 五倍子單寧脂質(zhì)體粒度測(cè)定及Zeta電位測(cè)定 將五倍子單寧脂質(zhì)體用雙蒸水稀釋100倍,再用水系0.45μm濾膜過(guò)濾,用激光粒度和Zeta電位儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑大小、粒徑分布及電勢(shì)大小。

1.2.4.3 五倍子單寧穩(wěn)定性研究 脂質(zhì)體屬于膠體分散體系,是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系。它在存放過(guò)程中會(huì)發(fā)生物理、化學(xué)、生物等方面的變化,從而影響其穩(wěn)定性能。本實(shí)驗(yàn)在 4℃與常溫條件下分別將五倍子單寧脂質(zhì)體放置0、10、20、30、40、50和60d,按1.2.2.3方法測(cè)定包封率(Y)的變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用DPS3.01數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子單寧脂質(zhì)體包封率測(cè)定

2.1.1 五倍子單寧溶液及空白脂質(zhì)體波長(zhǎng)掃描 對(duì)空白脂質(zhì)體和五倍子單寧溶液分別在190～600nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖所示:

圖1 空白脂質(zhì)體波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.1 Scanning spectra of blank liposome

圖2 五倍子單寧溶液波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.2 Scanning spectra of gallnut tannins

由圖1、圖2可知,空白脂質(zhì)體在194nm左右有吸收峰,而五倍子單寧有兩個(gè)大的吸收峰,分別是213nm和276nm?？紤]到空白脂質(zhì)體在213nm處也有較大吸收值,而在276nm處基本無(wú)吸收值,因此選擇276nm為測(cè)量五倍子單寧含量的最佳波長(zhǎng)。

2.1.2 五倍子單寧溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 五倍子單寧溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示,以五倍子單寧溶液的質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),得到線性回歸方程為y=0.0291x-0.001,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993,五倍子單寧溶液質(zhì)量濃度在0～50μg/mL范圍內(nèi)與吸光值有良好的線性關(guān)系。

圖3 五倍子單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of gallnut tannins

2.2 五倍子單寧脂質(zhì)體制備的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響 有機(jī)相和水相的體積比5∶1、磷酸鹽緩沖液的pH6.5,考察大豆卵磷脂和膽固醇的不同質(zhì)量比對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響情況。

圖4 大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比 對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.4 Effect of the ratio of soybean phospholipids to choleste on encapsulation

由圖4可見(jiàn),大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比對(duì)包封率有顯著的影響。隨著卵磷脂比例的增大,包封率也隨著增大,這是因?yàn)樽鳛轭?lèi)脂膜重要組成部分的膽固醇,它具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性和穩(wěn)定磷脂雙分子層的作用,當(dāng)比例過(guò)大時(shí),包封率也隨之降低,這是因?yàn)榻M成脂質(zhì)體的膽固醇量太少,膜難以形成且不牢固。所以,在大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比為2∶1時(shí),它們之間有良好的協(xié)同作用,包封率達(dá)到最大68.94%。

2.2.2 有機(jī)相和水相的體積比對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響 磷酸鹽緩沖液的pH6.5和大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比2∶1,考察有機(jī)相/水相不同體積比對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響情況。

圖5 有機(jī)相/水相的體積比對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.5 Effect of the ratio of oil phase to aqueous phase on encapsulation

由圖5可見(jiàn),五倍子單寧脂質(zhì)體的包封率隨著有機(jī)相/水相的體積比增加,包封率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。當(dāng)有機(jī)相/水相的體積比值增加到6∶1時(shí),包封率達(dá)到最大72.26%。

2.2.3 磷酸緩沖液pH對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響 大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比2∶1與有機(jī)相/水相的體積比6∶1,考察不同pH條件下對(duì)五倍子單寧脂質(zhì)體包封率的影響情況。

圖6 磷酸鹽緩沖液的pH對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響Fig.6 Effect of the pH of phosphate buffer solution on encapsulation

由圖6可見(jiàn),五倍子單寧脂質(zhì)體的包封率隨著磷酸鹽緩沖液pH的增加而增加,當(dāng)pH增加到6.5時(shí),達(dá)到最大,之后隨著磷酸鹽緩沖液pH的增加包封率反而變小。因此,本實(shí)驗(yàn)中磷酸鹽緩沖液最佳的pH為6.5。

制備五倍子單寧脂質(zhì)體的最佳條件為:大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為2∶1,有機(jī)相/水相的體積為6∶1,磷酸鹽緩沖液的pH為6.5。在此條件下制備的五倍子單寧脂質(zhì)體的包封率達(dá)72.26%。

2.3 五倍子單寧脂質(zhì)體質(zhì)量評(píng)價(jià)

肉眼觀察下五倍子單寧純化物呈淡黃色粉狀,五倍子單寧磷酸鹽緩沖液為淡黃色,脂質(zhì)體溶液為乳白色乳濁液。

2.3.1 五倍子單寧脂質(zhì)體的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu) 圖7為五倍子單寧脂質(zhì)體的光學(xué)顯微鏡照片。從圖7中可知,脂質(zhì)體呈橢球形和圓球狀,分布均勻。

圖7 光學(xué)顯微鏡下五倍子單寧脂質(zhì)體圖片(×40)Fig.7 Optical microscope picture of gallnut tannins liposome(×40)

2.3.2 五倍子單寧脂質(zhì)體粒度測(cè)定及Zeta電位測(cè)定 五倍子單寧脂質(zhì)體經(jīng)激光粒度和Zeta電位儀測(cè)定后,粒徑大小、分布及電荷性質(zhì)分別見(jiàn)圖8和圖9。

圖8 五倍子單寧脂質(zhì)體粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of gallnut tannins liposome

圖9 五倍子單寧脂質(zhì)體Zeta 電位Fig.9 Zeta potential of gallnut tannins liposome

由圖8可知,五倍子單寧脂質(zhì)體的粒徑呈正態(tài)分布,有效粒徑為(79.39±11.62)nm,分散系數(shù)(Pdi)為0.407,說(shuō)明粒徑分布較均勻。

由圖9可知,五倍子單寧脂質(zhì)體電位為-44.7mv,此電位處于-30～-50mv范圍內(nèi),說(shuō)明該脂質(zhì)體表面帶負(fù)電荷,且體系比較穩(wěn)定。

2.3.3 五倍子單寧脂質(zhì)體穩(wěn)定性 以時(shí)間為橫坐標(biāo),包封率為縱坐標(biāo),繪圖得五倍子單寧脂質(zhì)體穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化結(jié)果(圖10)。

圖10 五倍子單寧脂質(zhì)體穩(wěn)定性曲線Fig.10 Leakage rate curve of gallnut tannins and its liposome

由圖10可知,五倍子單寧脂質(zhì)體在4 ℃條件下儲(chǔ)存穩(wěn)定性良好,前20d包封率基本沒(méi)有變化,也就是說(shuō),脂質(zhì)體中的五倍子單寧在儲(chǔ)存的過(guò)程中基本沒(méi)有滲漏,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),包封率呈緩慢下降趨勢(shì),60d之內(nèi),包封率共下降20.05%,而外觀上脂質(zhì)體溶液也基本無(wú)絮凝和沉淀現(xiàn)象。但在常溫下放置的脂質(zhì)體包封率逐漸下降,并出現(xiàn)了不同程度的絮凝和沉淀,而且略有發(fā)霉現(xiàn)象,60d后被包裹的五倍子單寧已基本完全滲漏,因此五倍子單寧脂質(zhì)體宜在4℃條件下儲(chǔ)存。

3 結(jié)論

逆相蒸發(fā)法制備五倍子單寧脂質(zhì)體簡(jiǎn)單可行,最佳工藝配方為:SPC/CH為2∶1,O/A值為6∶1,緩沖液pH為6.5。在此條件下質(zhì)量濃度為1mg/mL的五倍子單寧溶液制備的五倍子單寧脂質(zhì)體包封率為72.26%。

肉眼觀察下五倍子單寧呈淡黃色粉狀;五倍子單寧磷酸鹽緩沖液為淡黃色;脂質(zhì)體溶液呈乳白色。從五倍子單寧脂質(zhì)體的光學(xué)顯微電鏡可知,脂質(zhì)體呈橢球形和圓球狀,分布均勻。五倍子單寧脂質(zhì)體的粒徑呈正態(tài)分布,有效粒徑為(79.39±11.62)nm,分散系數(shù)(Pdi)為0.407,粒徑分布較均勻。五倍子單寧脂質(zhì)體電位為-44.7mv,表面帶負(fù)電荷,體系比較穩(wěn)定。五倍子單寧脂質(zhì)體適宜的保存溫度為4℃。

[1]姜?jiǎng)?chuàng),吳相,劉軍海.超聲輔助法提取五倍子單寧酸的工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技,2009,45(2):11-13.

[2]鄭止善. 五倍子[M].上海:正中書(shū)局,1948:29-30.

[3]江凱. 五倍子單寧提取純化和抗突變作用研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2011.

[4]何蘭,姜志宏.天然產(chǎn)物資源化學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2008:465-495.

[5]喬彩云,李建科.五倍子及五倍子單寧的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2010,32(7):458-462.

[6]高晶,黃少烈.脂質(zhì)體的制備方法及其比較[J].中國(guó)油脂，2009(10):52-54.

[7]陳婷婷,曹光群.維生素C脂質(zhì)體的研究[D]. 無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.

[8]王汝興,張宇麗.脂質(zhì)體的研究進(jìn)展及其制備方法[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,25(2):183-185.

[9]王志龍,趙云英,李富桂.脂質(zhì)體應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)科技版,2011,5:26-27.

[10]李鵬.石榴皮多酚脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)[D].西安:陜西師范大學(xué),2010.

[11]陳大全,王昌利,王劍波,等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選元寶楓果殼中鞣質(zhì)的提取工藝研究[J].中草藥,2006,37(12):1816-1817.

[12]黃秋森.有機(jī)溶劑提取萃取法生產(chǎn)茶多酚工業(yè)實(shí)驗(yàn)[J].

現(xiàn)代化工,2006,26(9):48-51.

[13]任文霞,李建科.茶多酚脂質(zhì)體的制備[J].食品工業(yè)科技，2008(11):187-191.

[14]Yechezkel B.Liposome application:problems and prospects[J].Current Opinion in Colloid & Interface Science,2001,6(1):66-77.

[15]Fang Tian,Bo Li,Baoping Ji,etal. Identification and structure-activity relationship of gallotannins separated from Galla chinensis[J]. LWT-Food Science and Technology,2009,42(7):1289-1295.

[16]任文霞,李建科.凍干茶多酚脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009(6):609-612.

[17]任文霞,李建科.逆相蒸發(fā)法制備茶多酚脂質(zhì)體及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].生物加工過(guò)程,2009,7:2:68-73.

Preparation of gallnut tannins liposome and its quality evaluation

WU Xiao-xia,LI Jian-ke*

(College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Ultrasonic solvent extraction was used to eatarct the tannins in gallnut,and reverse-phase evaluation was used to prepare liposomes of gallnut tannins.The best technology was obtained and its physical and chemical properties were evaluated. The results showed that when the SPC/CH was 2∶1,the O/A was 6∶1,and the pH was 6.5,the entrapment efficiency of liposomes prepared by gallnut tannins was 72.26%,the effective diameter was(79.39±11.62)nm and the zeta potential was-44.7 mV,the favorable storage temperature was 4℃. Preparation process of liposome using reverse-phase evaporation was simple and feasible,high encapsulation efficiency,particle size uniformity,stability and can be used for preparation of gallnut tannins liposome.

gallnut tannins;liposomes;reverse-phase evaporation;quality evaluation

2014-03-21

吳曉霞(1982-)，女，在讀博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

*通訊作者:李建科(1960-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全與天然產(chǎn)物分離鑒定。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301598)；陜西省自然科學(xué)基金(2012JQ3014)；陜西師范大學(xué)中央高?；究蒲许?xiàng)目(GK 201304007)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)03-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.006