耿 蕊,劉繼超

(1.北京市育才學校,北京 100050；2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法快速檢測沙門氏菌

耿 蕊1,劉繼超2,*

(1.北京市育才學校,北京 100050；2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

為建立檢測沙門氏菌的快速、特異、靈敏的熒光定量PCR方法,以沙門氏菌invA基因為目的基因設計引物,并進行特異性、靈敏度和重復性實驗。結果顯示,建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測沙門氏菌的方法具有極強的特異性,其中沙門氏菌檢出限為86copies/mL,標準曲線的相關系數為0.999,擴增效率為104%,不同濃度質粒重復性擴增實驗Ct值的變異系數均<3%,符合WHO對中等實驗室提出的標準(CV 3%),顯示了良好的重復性。結果表明該方法具有快速、簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,可應用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗檢疫以及臨床診斷等領域。

SYBR GreenⅠ,熒光定量PCR,沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌,是常見的人畜共患的腸道致病菌,也是引起食物中毒最常見的致病菌[1],其廣泛分布于自然界中,是食品安全領域重點監(jiān)控的病原菌,對人類和動物健康具有極大危害[2]。目前國內外檢測沙門氏菌的方法很多,主要有金標試紙法、自動酶聯熒光免疫檢測系統(VIDAS)篩選法、快速酶促反應顯色培養(yǎng)基法、DNA探針技術和聚合酶鏈反應(PCR)技術[3-7]。以上方法不同時具備快速、靈敏度高、特異性強、適用范圍廣以及操作簡單等特點,很難滿足當前快速檢測要求[8-9]。熒光實時定量PCR技術克服了以上檢測方法的缺點,在眾多現代檢測技術中脫穎而出,成為檢測領域中越來越重要的一種快速檢測手段[10]。

本研究使用SYBR Green(染料法熒光定量PCR技術,針對編碼沙門氏菌吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白invA基因設計特異性引物,建立了檢測沙門氏菌的熒光定量PCR方法,可應用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗檢疫以及臨床診斷等領域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準菌株單增李斯特菌(ATCC-15313)、大腸桿菌(ATCC-25922)、金黃色葡萄球菌(CGMCC-1.0128)、沙門氏菌(CGMCC-1.1552)、表皮葡萄球菌(CGMCC-1.2429) 分別購自中國微生物菌種保藏中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

熒光定量PCR擴增儀7500 美國ABI公司；熒光定量PCR反應體系中各試劑 均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計 根據Genebank公布的沙門氏菌吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白invA基因序列,通過BLAST比對找出沙門氏菌特異的基因序列,采用Primer 5.0軟件設計熒光定量PCR引物,上游引物:5′-GTGAAATAATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,下游引物:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′,擴增片段大小為284bp,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 模板DNA的提取 在無菌條件下,用滅菌處理的接種環(huán)分別挑取實驗用標準菌落,接種于5mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜后培養(yǎng)基出現明顯混濁,即培養(yǎng)基中有大量菌體增殖。使用培養(yǎng)好的菌液進行沙門氏菌基因組DNA的提取,提取菌體DNA方法見參考文獻[11-12]。

1.2.3 引物的特異性實驗 對提取的所有細菌基因組DNA分別進行熒光定量PCR實驗,其中沙門氏菌(CGMCC-1.1552)作為陽性對照菌株,其他致病菌作為陰性菌株來檢驗引物的特異性。熒光定量PCR反應條件:95℃預變性10s；95℃變性5s,60℃退火34s,循環(huán)40次；在60℃退火34s階段收集熒光值,并在上述擴增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析步驟。

1.2.4 標準陽性模板的制備 以沙門氏菌基因組為模板,利用設計的引物擴增目的基因片段。反應體系為:模板1μL,上游引物0.5μL(25μmol/L),下游引物0.5μL(25μmol/L),10×擴增反應緩沖液2μL,PCR染料2μL,dNTPs 0.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,無菌超純水13μL,總體積為20μL,混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應,循環(huán)參數為95℃預變性3min,95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35個循環(huán),最后72℃延伸10min。擴增產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳,TaKaRa瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收條帶,連接到pGM19-T載體上,并導入到JM109感受態(tài)細胞中,37℃培養(yǎng)過夜,進行藍白篩選,挑取陽性克隆,由寶生物工程(大連)公司進行測序,對測序結果進行驗證。采用質粒試劑盒抽提重組質粒,按一定倍數稀釋后用紫外分光光度計檢測260nm下的OD值,計算其拷貝數(copies/mL)?？截悢?50(g/mL)×10-6×OD×6.02×1023/660(道爾頓/堿基)×擴增堿基數。

1.2.5 標準曲線建立及靈敏度的確定 SYBR Green Ⅰ染料法的反應體系按照大連寶生物熒光定量PCR(TaKaRa Premix Ex TaqTM)說明書操作。循環(huán)參數:95℃預變性10s；95℃變性5s,60℃退火34s,循環(huán)40次；在60℃退火34s階段收集熒光值,并在上述擴增條件后增加60～95℃的融解曲線步驟。

將質粒按10倍梯度稀釋,稀釋后溶液分別作為模板,進行熒光定量PCR擴增,確定熒光定量PCR的標準曲線以及靈敏度。

1.2.6 重復性實驗分析 取3種不同濃度沙門氏菌重組質粒,經重復性擴增實驗,觀察沙門氏菌實時熒光定量PCR擴增體系的重復性效果。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌基因組DNA的提取

使用1.2.2的方法提取沙門氏菌基因組DNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的沙門氏菌DNA,結果見圖1,電泳結果良好。

圖1 沙門氏菌基因組DNA電泳結果Fig.1 Results of DNA electrophoresis of Salmonella spp. Genome注:1,2.基因組DNA；M.100bp Marker。

2.2 熒光定量PCR引物的特異性實驗

invA 基因位于沙門氏菌毒力島1,編碼類型Ⅲ分泌系統蛋白(一種多面體內膜蛋白,與致病力相關)[13]。以不同菌株基因組模板進行熒光定量分析,只有沙門氏菌基因組模板有典型的熒光擴增曲線,大腸桿菌、表皮葡萄球菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌與陰性對照均無熒光擴增曲線,熒光擴增結果如圖2所示,其溶解曲線見圖3所示,表明該法檢測沙門氏菌具有良好的特異性。

圖2 熒光PCR引物特異性Fig.2 Specific curves of fluorescence PCR primers注:invA.陽性擴增曲線；NO invA.因陰性擴增曲線,圖3同。 圖2和圖3中不同的曲線代表針對inv基因的多次重復 實驗的結果,顯示了良好的重復性。

圖3 SYBR Green I溶解曲線Fig.3 Melting curves of SYBR Green I

2.3 轉化質粒鑒定

使用invA基因的特異性引物進行普通PCR擴增,擴增的結果見圖4,然后利用TaKaRa瓊脂凝膠提取試劑盒對目的片段進行回收,以回收的目的片段為模板進行克隆,進行藍白篩選,液體培養(yǎng)提取質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測序,結果證明擴增片段與數據庫中序列完全相符,所以認為成功轉入了PCR產物。

圖4 invA基因PCR擴增電泳結果Fig.4 Results of electrophoresis of the invA gene PCR amplification注:M:100bp Marker；1:invA基因的擴增結果。

2.4 熒光定量PCR標準曲線建立及靈敏度確定

用1.2.4方法公式計算后得出轉化質粒溶液的濃度為8.6×1012copies/mL,將轉化質粒溶液按10倍梯度稀釋,使用稀釋后溶液分別作為模板,進行熒光定量PCR擴增,以各標準模板的拷貝數為橫坐標,以其對應的Ct值為縱坐標,建立的標準曲線見圖5,擴增曲線見圖6,標準曲線為y=-3.645x+31.54,R2=0.999,Eff%=104%,得出該方法的靈敏度為86copies/mL。

圖5 invA基因擴增的標準曲線Fig.5 Standard curves of invA gene amplification

圖6 熒光PCR擴增曲線圖Fig.6 Amplification curves of fluorescence PCR

2.5 重復性實驗分析

對108、107和106copies/mL濃度沙門氏菌重組質粒進行重復性擴增實驗,測定結果進行統計學分析,分析結果見表1,不同濃度質粒重復性擴增實驗Ct值變異系數分別為0.2%、0.06%、0.07%,可見,Ct值的變異系數均<3%,符合WHO對中等實驗室提出的標準(CV3%),顯示了良好的重復性。

表1 不同濃度質粒重復性擴增實驗Ct值變異系數Table 1 Different concentrations of plasmid repetitive amplification test Ct value of coefficient of variation

3 結論與討論

本研究以沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的invA基因為目的基因設計引物,建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測沙門氏菌的方法具有極強的特異性,其中沙門氏菌檢出限為86copies/mL,標準曲線為y=-3.645x+31.54,相關系數R2為0.999,擴增效率為104%,不同濃度質粒重復性擴增實驗Ct值的變異系數均<3%,顯示了良好的重復性?？梢?本研究所建立的快速檢測沙門氏菌的熒光定量PCR方法,靈敏度高于傳統PCR,并且更易于自動化,具有快速、簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,可應用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗檢疫以及臨床診斷等領域,簡化了檢測流程、縮短了檢測時間,為食品污染的監(jiān)測和食物中毒事件的快速反應提供了技術支持,也必將為保障消費的生命健康、服務經濟建設發(fā)揮重要作用。

[1]Shauna L,Mettee Z,Sarah D,etal. Bennett,US outbreak of human Salmonella infections associated with aquatic frogs,2008-2011[J],Pediatrics,2013,131(3):724-731.

[2]岳昌武,呂玉紅,陳澤會.絕對定量PCR快速檢測豆豉沙門菌[J].中國釀造,2009,10:127-130.

[3]饒正華.沙門氏菌檢測方法研究進展[J].飼料研究,2002,10:15-17.

[4]黃素珍,杜元釗,張艷紅.檢測腸炎沙門氏菌ELISA方法的建立與應用研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,2006,8(2):196-200.

[5]呂曉紅,任紅.淺談食品沙門氏菌的檢測方法[J].畜產安全,2006,8:24-26.

[6]楊小鵑,吳清平,張菊梅,等.多重PCR檢測無公害畜禽肉和水產品中4種致病菌[J],微生物學通報,2005,32(3):95-101.

[7]Mcguonness S,Bsrry T,O’Grady J. Development and preliminary validation of a real-time RT-PCR based method targeting tmRNA for the rapid and specific detection of Salmonella[J]. Food Research International,2012,45(2):989-992.

[8]溫群文,袁夢,俞慕華.三種方法檢測沙門氏菌的比較研究[J].中國熱帶醫(yī)學,2006,6(11):1960-1962.

[9]孫雨,卜仕金,王美君.沙門氏菌的毒理作用機制及其檢測方法的研究進展[J].口岸衛(wèi)生控制,2009,12(2):56-58.

[10]Knutsson R,Lofstrom C,Grage H,etal. Modeling of 5-nuclease real-time responsesfor optimization of a high-throughput enrichment PCR procedure for Samonella enteric[J].J Clin Microbiol,2012,63(40):52-60.

[11]Moon J S,Lee A R,Kang H M,etal. Antibiogram and Coagulase Diversity in Staphylococcal Enterotoxin-ProducingStaphylococcusaureusfrom Bovine Mastitis[J]. Journal of Dairy Science,2007,90(4):1716-1724.

[12]劉繼超,姜鐵民,姜阿赤,等.多重PCR檢測金黃色葡萄球菌六型腸毒素基因的研究[J],食品科技,2012,37(6):304-307.

[13]Collazo C M,Galn J E. The invasion-associated type-III protein secretion system in Salmonella-a review[J].Gene,1997,192:51-59.

Rrapid detection ofSalmonellaspp. bySYBR Green I real-time polymerase chain reaction

GENG Rui1,LIU Ji-chao2,*

(1.Bei Jing Yu Cai School,Beijing 100050,China；2.Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd.,Beijing 100163,China)

According to the invA gene ofSalmonellaspp.,a pair of primers was designed to establish a real-time PCR. The rapid,specific,sensitive detection ofSalmonellaspp. was achieved,and the evaluation of detection sensitivity,specificity and repeatability was carried out. This method had good specificity. The limit of detection of the method was 86copies,correlation coefficient of the standard curve was 0.999 and amplification efficiency was 104%. Different concentrations of plasmid repetitive amplification coefficients of variation were less 3%,accord with standard preferred for moderately laboratory by WHO,indicating a good reliability. The SYBR Green I real-time PCR detection technology was rapid,simple,specific,and sensitive,which may be widely applied in the detection ofSalmonellaspp. in the field of food sanitation supervision,commodity inspection and detection,clinical diagnosis,etc.

SYBR Green I;real-time PCR;Salmonellaspp

2014-05-27

耿蕊(1971-)，女，本科，中教一級，研究方向:微生物學。

國家“十二五”支撐計劃(2012BAD12B06)；國家星火計劃項目(2012GA600001)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)03-0147-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.022

*通訊作者:劉繼超(1983-)，碩士，工程師，主要從事乳品質量安全方向研究工作