陳潔，王健

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，1、病理科；2、檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

CD137/CD137L是除CD28/B7之外的另一對(duì)重要的共刺激分子，在免疫細(xì)胞之間進(jìn)行雙向信號(hào)傳導(dǎo)，在免疫應(yīng)答、抗腫瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用[1]。CD137L屬于腫瘤壞死因子超家族9，是腫瘤壞死因子家族的一員，它主要表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞(APC)，成熟的樹突狀細(xì)胞，也可表達(dá)于活化的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等[2]。CD137信號(hào)傳導(dǎo)途徑既能提供刺激信號(hào)激活T細(xì)胞，使T細(xì)胞活化增殖分泌細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)這種刺激信號(hào)的同時(shí)它也介導(dǎo)反向刺激信號(hào)，誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細(xì)胞因子，這種雙向信號(hào)傳導(dǎo)更加迅速和精確地調(diào)節(jié)機(jī)體的生物反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)CD137L除了高表達(dá)于淋巴或骨髓來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表面，還表達(dá)于多種實(shí)體瘤細(xì)胞株表面，如Colo205、PC3、SKBR3等腫瘤細(xì)胞株[4]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)食管癌組織及癌旁組織中CD137L的表達(dá)，探討CD137L在食管癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異及CD137L的表達(dá)水平與食管癌的臨床病理特征、預(yù)后等臨床參數(shù)之間的關(guān)系，揭示CD137L在食管癌發(fā)生進(jìn)展中的作用，為尋找食管癌新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院和江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2010年1月至2013年12月期間經(jīng)手術(shù)切除病理診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌的石蠟標(biāo)本31例，購(gòu)買食管鱗狀細(xì)胞癌組織芯片30例，癌旁組織30例。其中男性36例，女性25例，年齡25~78歲，中位年齡59歲。這些標(biāo)本用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。收集華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院2014年5月至12月手術(shù)切除的食管癌組織18例，正常食管組織3例，經(jīng)福爾馬林浸泡時(shí)間均小于5h，采集未直接接觸福爾馬林的黃豆大小的癌組織、癌旁組織及正常食管組織，置-80℃冰箱保存。這些標(biāo)本用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。(癌旁組織是指距離癌組織邊緣1㎝以上沒(méi)有癌組織的正常食管組織)

1.2 試劑和方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)檢測(cè)CD137L在食管癌中的表達(dá)。61例食管癌組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。兔抗人CD137L單克隆抗體和SP試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。每次染色均用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。組織芯片購(gòu)自于上海芯超公司。

RT-PCR所用的試劑盒主要有固定組織RNA提取試劑盒、HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture等均購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司，Real Time PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。引物由上海生工合成。

1.3 總RNA提取及cDNA合成 根據(jù)固定組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，提取產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度并計(jì)算濃度。根據(jù)HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。先去除基因組DNA反應(yīng)，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成條件 37℃孵育 15min，85℃孵育 5s。合成產(chǎn)物進(jìn)行下一步熒光定量PCR。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR β-actin上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′， 下 游 引 物 5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物186bp；CD137L 上 游 引 物 5′ -CATGTTTGCGCAGCTGGTG-3′, 下 游 引 物 5′-CGCCGCAGCTCTAGTTGAAAG-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物 183bp。PCR反應(yīng)體系總體積為25μl：2xUltraSYBR Mixture(with ROX)12.5μl，上、下游引物混合物 1.5μl，模板cDNA1μl，RNase-Free Water10μl。PCR 反應(yīng)條件為95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40cycles。 融解曲線分析 95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。 每個(gè)cDNA標(biāo)本進(jìn)行三次PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)以x±s表示，最后結(jié)果按公式:2－△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.5 免疫組化結(jié)果判定CD137L蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒。結(jié)果判定：每例標(biāo)本在高倍鏡視野下隨意觀察5個(gè)視野。CD137L染色強(qiáng)度評(píng)分為：0 分(沒(méi)著色)，1 分(弱)，2 分(中等)，3分(強(qiáng))。 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分為：0 分(≤1%)，1 分(1%~10%)，2 分(10%-50%)，3 分(≥50)。 將兩者分?jǐn)?shù)疊加后分?jǐn)?shù)＞4分即為陽(yáng)性，0-3分為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用SPSS18.0軟件完成。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，臨床病理參數(shù)組間數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織中CD137L的分布和表達(dá)CD137L陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)。在61例食管癌組織中32例陽(yáng)性，表達(dá)率為52.5%，而鄰近的癌旁組織中呈陰性表達(dá)或者弱陽(yáng)性的非特異性表達(dá)(圖2)。

圖1 CD137L在食管癌組織中表達(dá)陽(yáng)性(×400)

圖2 CD137L在癌旁組織中表達(dá)陰性(×400)

2.2 與臨床病理資料的聯(lián)系 將61例食管癌患者按性別、年齡、腫瘤分化程度和分期等分組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CD137L的表達(dá)在中-高分化的食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性率高于低分化的鱗狀細(xì)胞癌(P=0.001)，在早期食管癌中的表達(dá)高于進(jìn)展期食管癌(P=0.048)，與其他因素?zé)o明顯相關(guān)，P>0.05(表 1)。

2.3 總RNA電泳圖 將提取的RNA產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可以清晰地看到28s、18s和5s三條帶，說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量可靠，可以進(jìn)行下一步的RT-PCR實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖3。

2.4 食管癌組織中CD137LmRNA的表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組CD137L和內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值見(jiàn)表2。食管癌組織中CD137L mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.075±0.355，高于癌旁組織的相對(duì)表達(dá)量0.031±0.383(P<0.05)。

表1 食管癌組織CD137L的表達(dá)與臨床病理資料的聯(lián)系

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)食管癌組織CD137LmRNA的表達(dá)

圖3 RNA1%瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

食管癌是世界上常見(jiàn)的八大惡性腫瘤之一，對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。研究顯示食管癌在國(guó)際上的發(fā)病率居惡性腫瘤發(fā)病率的第九位，死亡率居第八位。而我國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，特別是北方地區(qū)河南省一帶，以食管鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，全國(guó)每年發(fā)病人數(shù)約25.9萬(wàn)人，占全世界每年發(fā)病人數(shù)的一半以上，發(fā)病率居全國(guó)惡性腫瘤第五位，死亡率居第四位[5,6]。到目前為止，食管癌的確切病因尚未完全明了，哪些因素與食管癌的生存和預(yù)后相關(guān)，以及尋找治療食管癌的新的方法等等都是我們迫切需要解決的問(wèn)題。

通過(guò)對(duì)CD137/CD137L信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究發(fā)現(xiàn)，CD137L作用于CD137后可以通過(guò) TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放以及調(diào)控單核細(xì)胞的增殖和分化等，影響生物學(xué)行為?？梢源龠M(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞的活化、增殖，細(xì)胞因子分泌增加，保護(hù)T細(xì)胞免于活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 (activation-induced cell death，AICD)[7-9]。同時(shí)它也介導(dǎo)反向共刺激信號(hào)，因此能誘導(dǎo)APC活化增殖和分泌細(xì)胞因子。誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子M-CSF，促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖，延長(zhǎng)其生存；促進(jìn)炎性因子 IL-6、IL-8、TNF-α的分泌，抑制抗炎性因子IL-10的分泌等[10]。其中IL-8是炎細(xì)胞趨化因子，參與白細(xì)胞聚集,也是許多惡性腫瘤的生長(zhǎng)因子[11]。T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞通過(guò)CD137/CD137L雙向作用而相互活化，介導(dǎo)雙向信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)免疫反應(yīng)。

CD137/CD137L除了表達(dá)在免疫細(xì)胞也可以表達(dá)在其他非免疫細(xì)胞。Salih HR等研究發(fā)現(xiàn)人的不同癌細(xì)胞株和來(lái)源于這些細(xì)胞株的實(shí)體瘤及人體腫瘤細(xì)胞上均有CD137L的表達(dá)[4]。還有人研究了結(jié)腸癌、肺癌、淋巴瘤和肝癌等腫瘤細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞不同程度地表達(dá)CD137L[12]，這與Salih HR等研究結(jié)果一致，說(shuō)明CD137L在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)是普遍現(xiàn)象。在人類惡性血液疾病中，CD137L能將生長(zhǎng)和生存信號(hào)轉(zhuǎn)換給腫瘤細(xì)胞而且還能引發(fā)抑制腫瘤生長(zhǎng)的回應(yīng)[13,14]。

一般認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤組織通常低表達(dá)或不表達(dá)共刺激分子從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別。多種惡性腫瘤細(xì)胞株均表達(dá)CD137L，并且該分子具有的生物學(xué)活性，能促使腫瘤細(xì)胞增殖、分泌IL-8，降低細(xì)胞凋亡，減弱抗癌藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)。另一方面通過(guò)結(jié)合CD137，能促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ,抑制增殖促進(jìn)凋亡。CD137L表達(dá)于多種人體惡性腫瘤組織細(xì)胞表面，CD137則表達(dá)于腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，這一對(duì)共刺激分子通過(guò)雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腫瘤的發(fā)生進(jìn)展及轉(zhuǎn)移可能具有特殊的生物學(xué)意義。CD137L作為共刺激分子，因其逆向信號(hào)的存在，使它的作用不單是提供第二信號(hào)引起T細(xì)胞活化的功能[15]。研究表明 CD137L參與腫瘤的發(fā)展，通過(guò)與CD137交聯(lián)向表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞傳遞逆向信號(hào)，產(chǎn)生的效應(yīng)可以是增強(qiáng)免疫，最近關(guān)于CD137L在非小細(xì)胞肺癌中的作用的研究證明了這一點(diǎn)[16]。也可以使機(jī)體腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，影響機(jī)體免疫功能。有研究顯示CD137L是診斷非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的一個(gè)新的標(biāo)記,它的表達(dá)可以作為免疫治療淋巴瘤或其他惡性腫瘤的靶點(diǎn)[17]。因此，進(jìn)一步研究CD137L參與腫瘤發(fā)展的機(jī)制使CD137L可能成為抗腫瘤免疫治療的一個(gè)靶標(biāo)。

本研究中，我們運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)61例食管癌組織及30例癌旁組織CD137L蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示食管癌組織中CD137L的表達(dá)為陽(yáng)性，在癌旁組織中的表達(dá)為陰性。CD137L表達(dá)在食管癌細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)18例食管癌組織及癌旁組織中CD137LmRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織中CD137LmRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織。CD137L蛋白的表達(dá)在中-高分化的食管鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性率高于低分化的鱗狀細(xì)胞癌(P=0.001)，在早期食管癌中的表達(dá)高于進(jìn)展期食管癌(P=0.048)。中-高分化的鱗狀細(xì)胞癌和早期的食管癌的預(yù)后均要好于低分化鱗狀細(xì)胞癌和進(jìn)展期食管癌。提示CD137L對(duì)預(yù)后有一定的影響，高表達(dá)CD137L的食管癌患者預(yù)后要相對(duì)較好。作用機(jī)制可能是CD137L和CD137相互作用向表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞傳遞逆向信號(hào)產(chǎn)生增強(qiáng)免疫的效應(yīng)，而具體的作用途徑有待進(jìn)一步研究。由本文的結(jié)果推斷CD137L可以作為食管癌一個(gè)新的診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。

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