馮 歡，張 超，張哲愷，章 銘，張 豐

（第四軍醫(yī)大學1.學員旅十五連;2.學員旅十三連;3.基礎部病理學教研室，陜西西安 710032）

H3K27me3去甲基化酶Jmjd3調節(jié)胎鼠肺上皮細胞增殖和分化

馮 歡1，張 超1，張哲愷2，章 銘2，張 豐3*

（第四軍醫(yī)大學1.學員旅十五連;2.學員旅十三連;3.基礎部病理學教研室，陜西西安 710032）

目的 分析H3K27me3特異去甲基化酶Jmjd3（KDM6B）在胎鼠肺生長發(fā)育過程中的作用。方法 HE染色、PAS染色和免疫組化方法檢測E19.5Jmjd3基因敲除胎鼠肺生長發(fā)育情況。結果 與野生型（Jmjd3+/+）胚胎比較，雜合型敲除（Jmjd3+/－）胚胎的肺發(fā)育稍差，但純合型敲除（Jmjd3－/－）胚胎肺發(fā)育明顯不良，支氣管的纖毛上皮細胞和Clara細胞以及肺泡的Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞分化不良。Jmjd3－/－胚胎肺上皮細胞增殖指數高于野生型和Jmjd3+/－組，未發(fā)現(xiàn)Jmjd3－/－胚胎肺上皮細胞凋亡異常。結論 Jmjd3對胎鼠肺上皮細胞的增殖和分化具有重要調節(jié)作用。

Jmjd3;肺上皮細胞;增殖;分化

*通信作者（corresponding author）:zhf1975@fmmu.edu.cn

近年來表觀遺傳學研究發(fā)現(xiàn)核小體組蛋白N-端的氨基酸可發(fā)生甲基化和乙酰化等化學修飾，這些修飾組合起來形成“組蛋白密碼”，決定基因的轉錄狀態(tài)［1］。隨著特異產生或降解這些修飾的基因發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳分子的功能學研究成為新的研究熱點［2-3］。Jmjd3是一個特異降解組蛋白H3第27位氨基酸（賴氨酸）上3甲基（H3K27me3）的組蛋白去甲基化酶［4-8］，Jmjd3敲除基因小鼠實驗表明Jmjd3對于巨噬細胞、神經元和軟骨細胞發(fā)育分化具有重要調節(jié)作用［9-11］，由于Jmjd3－/－小鼠出生后 1 ～2 h內死亡，伴全身紫紺，因此Jmjd3－/－小鼠的肺發(fā)育可能存在異常［11］，為了檢測 Jmjd3是否調節(jié)肺發(fā)育，本研究從組織學水平探討Jmjd3在肺上皮細胞的增殖和分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Jmjd3+/－小鼠由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所陳德桂研究員惠贈，Jmjd3－/－小鼠由Jmjd3+/－雌雄小鼠交配產生。由于Jmjd3－/－小鼠出生后死亡，因此，本研究以E19.5胎鼠肺組織作為研究對象。抗體如下:兔抗Jmjd3抗體、兔抗AQP5抗體和兔抗 Ki67（abcam公司），兔抗H3K27me3抗體（Millpore公司），兔抗 β-tubulin抗體（GeneTex公司）、兔抗CCSP抗體和兔抗ABCA3抗體（Seven hills bioregents公司）。TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）凋亡檢測試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 敲除Jmjd3基因:Jmjd3基因敲除方法見前期研究報道［11］，小鼠遺傳背景為 C57/BL6，Jmjd3F/+與EIIa-cre小鼠（Jackson實驗室 No.003724）交配產生Jmjd3+/－小鼠。本實驗采用5只Jmjd3+/－雄鼠與10只Jmjd3+/－雌鼠交配。每籠放置1只雄鼠和兩只雌鼠，24 h后雌雄分開飼養(yǎng)。小鼠在第四軍醫(yī)大學動物實驗中心飼養(yǎng)，條件為SPF級別環(huán)境，飼養(yǎng)室溫度控制在20～23℃，飲用水和飼料經過高溫消毒?；蛐丸b定所需DNA模板來自胎鼠尾巴，用常規(guī)PCR方法鑒定，PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，紫外顯影儀下拍照分析。基因鑒定引物序列249-F:5'-GAGACCCCTGTTTGGTTACC AG-3';250-F:5'-GCAGTATAAAACCAGAGGAAAC AATG-3';251-R:5'-GAGGCAGAACCTGAGCAAGAC C-3'.以249/251和250/251為引物，PCR產物大小約400 bp。249/251和250/251引物PCR結果雙陽性為雜合型敲除，249/251引物PCR結果陽性，而250/251引物PCR結果陰性為野生型，249/251引物PCR結果陰性，而250/251引物PCR結果陽性為純合型敲除。

1.2.2 組織處理和染色:給E19.5胎鼠編號后，體視鏡下剪開每只胎鼠胸腔，取肺組織，4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，對切片進行蘇木精和尹紅或糖原（PAS）染色，之后無水乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。普通光學顯微鏡觀察小鼠肺組織結構和發(fā)育情況。

1.2.3 免疫組織化學染色:石蠟切片脫蠟至水，PBS浸泡5 min。3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS洗滌5 min×3次（置搖床上）。正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，4℃過夜。從冰箱取出，室溫復溫1 h，之后 PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量抗兔辣根酶標記二抗（1/500）工作液，室溫孵育2 h。PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色劑顯色1～5 min。蒸餾水沖洗，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。普通光學顯微鏡觀察小鼠肺發(fā)育和分化標記物表達情況。

1.2.4 細胞增殖和凋亡分析:用免疫組織化學染色細胞檢測細胞增殖。用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡，方法按照說明書進行。普通光學顯微鏡觀察小鼠肺細胞增殖和凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Jmjd3基因敲除胎鼠結果

Jmjd3+/－雌雄小鼠交配后19.5 d檢測，發(fā)現(xiàn)7只小鼠懷孕，處死孕鼠，觀察到平均每只孕鼠體內有6～9只胎鼠，共計52只胎鼠。Jmjd3+/+胎鼠有 13 只，Jmjd3+/－胎鼠 27 只，Jmjd3－/－胎鼠12只，一窩代表性胎鼠基因型鑒定結果（圖1）。Jmjd3表達強度在Jmjd3+/－胎鼠肺組織略低于Jmjd3+/+的胎鼠肺組織，在Jmjd3－/－胎鼠肺組織檢測不到 Jmjd3蛋白信號（圖2A～C）。相反，H3K27me3的信號強度在Jmjd3－/－胎鼠肺組織最強（圖2D～F）。

圖1 小鼠胚胎基因型鑒定Fig 1 Genotype of mouse embryos

2.2 組織形態(tài)學分析Jmjd3基因敲除對胎鼠肺發(fā)育的影響

每個顯微鏡低倍視野下Jmjd3+/－胎鼠的肺泡數目略少于Jmjd3+/+胎鼠肺泡的數目，但是Jmjd3+/－胎鼠的肺泡間隔卻略寬于Jmjd3+/+胎鼠的肺泡間隔 （圖3A:a～f;3B）。另外，Jmjd3+/+胎鼠的大部分支氣管上皮細胞頂端已經明顯空泡化，而Jmjd3+/－胎鼠的支氣管上皮細胞只有少數細胞的頂端出現(xiàn)空泡化 （圖3A:c，f;3B）。相對于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠肺泡數目明顯減少，肺泡管腔狹窄或缺如，肺泡間隔明顯增厚并且細胞數目增加，而且，Jmjd3－/－胎鼠支氣管上皮細胞看不到頂端空泡化細胞 （圖3A:a～i;3B）。

2.3 Jmjd3基因敲除對肺上皮細胞分化的影響

相對于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠，Jmjd3－/－胎鼠細支氣管內Tubulin和CCSP陽性細胞明顯減少，同時，肺泡內ABCA3和AQP5陽性細胞數目也嚴重減少（圖4）。另外，PAS染色發(fā)現(xiàn)Jmjd3－/－胎鼠支氣管和肺泡內存在大量含糖類黏液（圖5）。

2.4 Jmjd3基因敲除對肺上皮細胞增殖和分化的影響

Ki67在Jmjd3－/－胎鼠肺組織中表達率明顯高于Jmjd3+/+和Jmjd3+/－胎鼠組（圖 6A:a ～ c，6B）。Jmjd3+/+、Jmjd3+/－和Jmjd3－/－胎鼠肺組織中細胞凋亡沒有明顯差異（圖6A:d～f，6C）。

3 討論

圖2 肺組織的Jmjd3（A～C）和H3K27me3（D～F）的免疫組織化學Fig 2 Immnohistochemistry assays of Jmjd3（A～C）and H3K27me3（D～F）in lung tissues（×200）

圖3 組織學方法檢測小鼠肺發(fā)育情況Fig 3 Developmental status of mice lung were examined by tissue assays

圖4 分子標志檢測方法分析小鼠肺發(fā)育情況Fig 4 Developmental stantus of mice lung by molecalar markers investagations

多種肺疾病的發(fā)生與肺早期發(fā)育分化不良有關，但是關于肺正常發(fā)育的分子機制目前還不完全清楚［12-13］。基因敲除小鼠實驗表明轉錄因子和細胞信號傳導分子對肺的正常發(fā)育和分化具有重要調節(jié)作用，但是有關表觀遺傳調控分子在肺發(fā)育分化過程中的作用還不清楚［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)H3K27me3去甲基化酶Jmjd3基因敲除小鼠有明顯的肺發(fā)育不良，表現(xiàn)為肺泡數目減少、肺泡間隔增寬、處于增殖期的肺泡和支氣管上皮細胞數目增加，以及支氣管和肺泡內存在大量未吸收黏液。該結果拓展了從表觀遺傳角度理解肺發(fā)育和分化的分子機制，為進一步研究Jmjd3在肺相關疾病中的作用奠定了基礎。Jmjd3影響肺上皮細胞分化的實驗結果已報道［14］，但是該文獻結果沒有提及Jmjd3+/－胎鼠的肺發(fā)育情況，也沒有提及Jmjd3基因敲除對肺上皮細胞增殖和凋亡的影響。本研究用免疫組織細胞化學方法檢測到Jmjd3基因敲除后，H3K27me3在肺上皮細胞內整體水平升高，提示Jmjd3促進肺上皮細胞分化與其去甲基化酶的催化活性有關。與該推測一致，Jmjd3直接降解SP-B和AQP5基因啟動子上的H3K27me3水平，從而影響肺Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細胞的分化［14］。結合實驗結果，推測Jmjd3蛋白可能直接調節(jié)脂滴轉運蛋白ABCA3和水通道蛋白AQP5的表達，從而促進肺上皮細胞的分化成熟，Jmjd3基因敲除將導致這些基因無法表達，引起支氣管和肺泡內的液體無法被吸收，最終導致Jmjd3－/－胎鼠出生后無法正常呼吸而死亡。

圖5 水吸收程度檢測小鼠肺發(fā)育狀態(tài)Fig 5 Developmental status of mice lung were exammed by water absorptivity assays

圖6 增生和凋亡檢測小鼠肺發(fā)育情況Fig 6 Developmental status of mice lung were examined by proliferation and apoptisis assays

最近Jmjd3基因敲除小鼠沒有明顯的肺發(fā)育異常［15］，原因是并沒有完全敲除Jmjd3，而只是敲除了Jmjd3 的一個剪接體（isoform）［5，14］。由于 Jmjd3 有兩個轉錄起始位點（TSS），其中一個TSS位于第1外顯子的上游，另一個TSS位于第1和第2外顯子之間［5］。該作者在第1和第2個外顯子之間的內含子區(qū)域插入1個剪切受體盒子，因此只敲除第1個TSS，結果只敲除了Jmjd3基因的1個剪接體［15］。因此，小鼠表型類似本研究的Jmjd3雜合型基因敲除小鼠，而與本研究的Jmjd3－/－小鼠表型存在明顯差異。

綜上所述，Jmjd3在支氣管和肺泡上皮的發(fā)育和分化過程中具有重要作用，其發(fā)揮作用的主要機制可能是通過調節(jié) β-Tubulin、CCSP、ABCA3和AQP5等分化基因的表達而促進肺上皮細胞分化，具體的分子機制還需要進一步的工作來驗證。

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H3K27me3 demethylase Jmjd3 regulates proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice

FENG Huan1，ZHANG Chao1，ZHANG Zhe-kai2，ZHANG Ming2，ZHANG Feng3*

（1.Company 15;2.Company 13，Student Brigade;3.Dept.of Pathology，Basic Medical College，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

ObjectiveTo investigate the role of H3K27me3 demethylase Jmjd3（KDM6B）during the development of lung in embryonal mice.MethodsJmjd3knockout embryos of E19.5 mice were examined by HE，PAS and immnohistochemistry assays.ResultsThe developmental defects of the lung of Jmjd3 heterozygous（Jmjd3+/－）embryos were mild is compared toJmjd3+/+embryos.However，Jmjd3－/－mice suffered from the severe hypoplasia of lung tissue.Differentiated defects of ciliated cell，Clara cell，typeⅠ and Ⅱ alveolar epithelial cells were observed inJmjd3－/－embryos.The index of cell proliferation was increased inJmjd3－/－embryos as compared to wildtype andJmjd3+/－embryos.No difference in apoptosis profile was found in these embryos.ConclusionsJmjd3 is essential for proliferation and differentiation of embryonal lung epithelia of mice.

Jmjd3;epithelia of lung;proliferation;differentiation

Q132.7

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.006

1001-6325（2015）09-1176-06

2014-01-19

2015-04-27

國家自然科學基金（31000559）

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