鄧桂球，張 蓓，孔秀娟 ，張榕文 ，勞梓釗，萬玉華，李 耿

(1.廣東省廣州市白云區(qū)第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 510140;2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405;3.霸王＜廣州＞有限公司)，廣東 廣州 510006)

類固醇5α-還原酶是雄激素代謝的關鍵酶，催化各種類固醇底物的△4，5雙鍵還原，使睪酮(T)轉化為生物活性更強的另一種雄激素——雙氫睪酮(DHT)[1]。5α-還原酶是定位于靶細胞微粒體上的膜蛋白，目前認為其有3種同工酶[2]，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。5α-還原酶Ⅰ主要存在于肝臟及非生殖器官皮膚，發(fā)揮生理作用的最適pH為6～9;而5α-還原酶Ⅱ主要存在于前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊，作用最適pH為5.5[3]，5α-還原酶Ⅲ研究較少，其在難治愈的前列腺癌中過度表達[4]。多種疾病如前列腺增生[5]、雄激素脫發(fā)[6]、痤瘡[7]、多囊卵巢綜合征、男性假兩性體畸形、女性多毛癥[8]等均與局部雄激素代謝異常或雄激素作用有關，而5α-還原酶在其中有重要作用。目前市場上有許多合成的甾體和非甾體5α-還原酶抑制劑，但其往往有很多不良反應，難以滿足廣大患者的需求。因此，從中藥中篩選出高效低毒的新型5α-還原酶抑制劑，將其運用于前列腺增生、雄激素脫發(fā)、痤瘡等醫(yī)藥健康產品的研究，具有重要的研究價值和廣闊的市場前景。近年來，國內外已有超過20種藥物被報道具有較強的5α-還原酶抑制活性。紅花有活血祛瘀功效，為中藥育發(fā)液中臣藥，有促進毛發(fā)生長的作用[9]。為進一步探討其治療雄激素脫發(fā)的機理，本試驗中以5α-還原酶為研究靶點，考察紅花提取物對該酶的影響，現報道如下。

1 材料與儀器

藥品與試劑:紅花(霸王＜廣州＞有限公司)，經廣州中醫(yī)藥大學賴小平教授鑒定為菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.的干燥花;非那雄胺(美國默沙東制藥有限公司);Easy-Lowyer蛋白測定試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，批號為2813B);睪酮(純度超過98%，BR，批號為#TCL201403);還原輔酶Ⅱ四鈉鹽/β-NADPH(純度 98%，Roche公司，批號為 10041939103);Tris-HCL(南京森貝伽生物科技有限公司，批號為SBJ0055);PMSF(純度超過99%，廣州齊云生物技術公司，批號為#KY201211);DTT(純度超過99%，廣州齊云生物技術公司，批號為#py200611);磷酸鹽緩沖液(PBS，上海立菲生物科技有限公司，批號為8113275);其他化學試劑都為國產分析純。

儀器設備:戴安高效液相色譜儀(UVD170U型檢測器，P680泵，ASI-100型自動進樣器，TCC-1005型柱溫箱);北京迪馬DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);TDL-5-A 型離心機(上海安亭科學儀器廠);XXW-80A型旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);BS110S型萬分之一分析天平(香港佳立＜國際＞有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);RT-2100C型酶標儀(深圳雷杜公司)。

動物:雄性SD大鼠10只，SPF級，體重180～220 g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號為20130020。

2 方法與結果

2.1 5α －還原酶的制備及定量[2，10]

制備:取雄性SD大鼠10只，禁食不禁水過夜后脫臼處死，迅速取肝臟及附睪(剝離脂肪組織)，稱重，于冰盤上剪碎，加入3倍量預冷的勻漿液(1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris-HCL 緩沖液;pH 分別為 5.5，5.5，6 ～9，6.8)在玻璃勻漿器中勻漿。勻漿液于4℃及3 500 g離心2次，每次10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g離心50 min，取上清液即為粗微粒體酶，加一定量甘油，分裝，保存于-80℃超低溫冰箱中，臨用前取出。

定量:采用改良Lowry法定量測定蛋白含量，以酶提物中的總蛋白含量表示5α-還原酶的濃度，操作按照試劑盒說明書進行。BSA 標準曲線為 Y=0.132 9 X+0.097 7，R2=0.993 2。經計算肝臟中粗酶濃度為12.17 g/L(Ⅰ型酶)，附睪中粗酶濃度為5.77 g/L(Ⅱ型酶)。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 -水(70∶30);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;檢測波長:242 nm;進樣量:20 μL。

2.2.2 方法學考察

專屬性試驗:精密吸取睪酮對照品溶液、空白溶液、空白溶液加對照品混合液，各取20 μL注入高效液相色譜儀。在上述色譜條件下，睪酮對照品峰峰形對稱，與其他組分分離度好，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察:精密稱取睪酮標準品36 mg，用甲醇配制成濃度為5 mmol/L的睪酮母液。將溶液逐級稀釋，質量濃度依次為1.44，7.20，14.40，28.80，115.20，230.40，460.80 μg/mL。按擬訂色譜條件進樣，以睪酮峰面積(A)對質量濃度(C)作圖，繪制標準曲線。睪酮標準曲線為 A=0.263 C-0.410 6，R2=0.999 9。結果表明，睪酮質量濃度在 1.44～460.8 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

精密度試驗:取睪酮標準品母液，加甲醇稀釋，得濃度為100 μmol/L的供試品溶液。按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次。結果的 RSD為1.01%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取睪酮供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，2，6，12，24，48 h 時進樣。結果的 RSD 為 1.37%(n=6)，表明睪酮溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗:取睪酮供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進樣。結果的 RSD為2.11%(n=6)，表明方法的重復性良好。

2.3 5α－還原酶抑制劑體外模型的建立

5α-還原酶活性測定方法[10-12]:設置不同反應管和對照管，將Tris-HCL緩沖液、酶提取液、T、樣品(陽性對照及空白對照)、NADPH依次加入反應管內，混合均勻，37℃反應30min，于0，30min時取樣0.5 mL，加甲醇1 mL中止反應，渦旋1 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，HPLC法檢測。5α-還原酶活性以30 min內每mg酶液轉化睪酮的量[T μmol/L(mg protein.30 min)]表示;T轉化率%=(T0濃度測定值-T30濃度測定值)/T0濃度測定值×100%;5α-還原酶活性抑制率%=(未加抑制劑的反應體系T30轉化量-加抑制劑的反應體系T30轉化量)/未加抑制劑的反應體系T30轉化量×100%。

微量反應體系的確立和反應條件優(yōu)化:經過反復摸索，建立總量為1 000 μL的反應體系，見表1。為獲得最佳酶活性測定反應參數，對底物T濃度、NADPH濃度、酶濃度、反應溫度、反應時間條件進行優(yōu)化。測得Ⅰ型酶的最佳反應條件為底物T濃度1 000 μmol/L，NADPH 濃度 1 mmol/L，粗酶濃度 0.7 g/L，反應溫度37℃，反應時間30 min;Ⅱ型酶為底物T濃度1 000 μmol/L，NADPH濃度1 mmol/L，粗酶濃度3 g/L，反應溫度37℃，反應時間30 min。

表1 5α-還原酶反應體系組成(μL)

非那雄胺對酶活性的影響:向反應體系中加入特異性Ⅱ型5α - 還原酶抑制劑非那雄胺，濃度依次為 0.02，0.1，0.5，1 μmol/L，按擬訂方法進行酶促反應。求非那雄胺對酶活性的抑制率及IC50，評價該模型的可靠性。由圖2可見，非那雄胺可呈劑量依賴性抑制5α-還原酶活性，抑制率高達83.67%，其IC50為212 nmol/L，與國外文獻報道[13]的237 nmol/L接近。表明本試驗采用HPLC法測定建立的5α-還原酶活性測定方法具有專一性，該模型可靠、穩(wěn)定，可用于5α-還原酶抑制劑的篩選。

圖2 非那雄胺濃度與抑制率關系

2.4 紅花水提物對Ⅰ型及Ⅱ型5α－還原酶活性的影響

紅花水提物樣品的制備:取紅花干燥藥材150 g，室溫下加入10倍量蒸餾水浸泡30 min，回流提取2次，每次0.5 h，8層紗布過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，將浸膏置于坩堝中，真空干燥箱中干燥，得紅花藥材粉末27.60 g，計算回收率?；厥章?%)=干粉量/生藥材量×100%，得回收率為18.40%。試驗前取紅花干燥粉末，用蒸餾水制成 50，10，2，0.4 g/L 的藥物溶液，受試藥物反應質量濃度分別為 2.5，0.5，0.1，0.02 g/L。

紅花水提物對Ⅰ型酶活性的影響:分別取不同質量濃度的紅花樣品溶液，按擬訂方法進行酶促反應，求紅花水提物對Ⅰ型酶活性的抑制率，結果見表2。可見，與正常組比較，紅花提取物0.02 g/L劑量組酶活力、T轉化率均無顯著性差異(P＞0.05)，0.1，0.5，2.5 g/L 劑量組酶活力、T 轉化率均顯著性降低(P ＜0.05)。說明紅花提取物低劑量無顯著5α-還原酶活性，體外劑量大于0.1 g/L時可極顯著抑制Ⅰ型5α-還原酶活性，抑制率高達88.12%。

表2 紅花提取物對Ⅰ型酶活性的影響

紅花水提物對Ⅱ型酶活性的影響:分別取不同質量濃度的紅花樣品溶液，按擬訂方法進行酶促反應，求紅花水提物對Ⅱ型酶活性的抑制率，結果見表3。可見，與正常組比較，紅花提取物0.1 g/L劑量組酶活力、T轉化率均無顯著性差異(P＞0.05);0.1，0.5，2.5 g/L 劑量組酶活力、T 轉化率均極顯著性降低(P ＜0.01)，說明紅花醇提物低劑量無顯著5α-還原酶活性，體外劑量大于0.1 g/L時可極顯著抑制Ⅱ型5α-還原酶活性，抑制率高達61.65%。

表3 紅花提取物對Ⅱ型酶活性的影響

3 討論

目前，5α-還原酶活性測定方法有紫外分光法、HPLC法、氣相色譜-質譜(GC-MS)法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法、放射性同位素法、熒光法等。GC-MS法對試驗儀器的要求較高;同位素法是國外最常用的甾體5α-還原酶的活性測定方法，其靈敏度高，同時可測定很多樣品，但具有放射性污染，同位素標定和測定的誤差、層析板處理過程中的操作誤差等隨機測量誤差較多等缺點;紫外法操作簡單，但由于所提取的酶為粗酶，純度不高，且測定的目標物NADPH對5α-還原酶并無專一性，易受到其他酶的干擾而造成檢測偏差;ELISA法比定量T更能準確反映5α-還原酶活性，但實際價格較貴。故本研究中選擇HPLC法，以5α-還原酶的底物T為檢測對象，排除了其他酶的干擾，且定量準確，誤差較小。選用非那雄胺為陽性對照藥評價該模型的可靠性，結果顯示非那雄胺可呈劑量依賴性抑制5α-還原酶活性，抑制率高達 83.67%，其 IC50為212 nmol/L，與文獻[13]報道的237 nmol/L相近。說明本研究中建立的HPLC法5α-還原酶抑制劑篩選模型穩(wěn)定、可靠，可用于5α-還原酶抑制劑篩選。

彭永德等[14]指出，5α-還原酶Ⅱ對類固醇底物有較高的親和力(Km為nmol范圍)，而5α-還原酶Ⅰ的親和力較低(Km在μmol水平)。本研究結果顯示，5α-還原酶Ⅱ酶活力約 384.5 T μmol/L(mgprotein·30 min)，是5α-還原酶Ⅰ酶活力的10倍以上，其T轉化率約47.82%，而5α-還原酶Ⅰ為18.45%。在細胞漿內，5α-還原酶可以將T轉化為生物活性更強的DHT，T和DHT與同一種雄激素受體(AR)結合，但DHT與AR的親和力是T的5倍以上。當AR與DHT等雄激素結合后，AR的LBD構象發(fā)生改變，與Hsp90等結合蛋白分離，AR形成活化的同源二聚體并進入細胞核中，識別并結合相應的靶基因啟動子區(qū)的雄激素受體反應元件(ARE)，誘發(fā)或抑制靶基因的轉錄，合成特異性的信使RNA及蛋白質，從而發(fā)揮其生物學功能，促進性器官的發(fā)育，促進毛發(fā)、胡須等的生長等。因而轉化T活力更強的5α-還原酶Ⅱ多分布在睪丸、附睪等生殖器官及頭皮毛囊，主要對雄激素的合成代謝起作用;另一方面，T及其代謝產物DHT又均可刺激5α-還原酶Ⅱ基因的表達[15]，當5α-還原酶Ⅱ過表達時，又導致局部的雄激素過多，從而引起前列腺增生[5]、雄激素脫發(fā)[6]等疾病。5α-還原酶Ⅰ多分布在肝臟和非生殖器官皮膚，主要對雄激素和其他類固醇激素的分解代謝起作用，5α-還原酶Ⅰ過多表達時常導致痤瘡[7]、女性多毛癥[8]等。

5α-還原酶是體內參與雄激素代謝的一種重要的代謝酶，與全身多系統(tǒng)的疾病相關，抑制5α-還原酶的活性已成為一些疾病的治療靶點。雖然2種異構酶表達具有相對的組織或細胞特異性，生理功能亦具有差異，如5α-還原酶Ⅱ主要分布在生殖系統(tǒng)、頭皮毛囊內毛根鞘等部位，與生殖系統(tǒng)發(fā)育、毛發(fā)生長有關，5α-還原酶Ⅰ多分布在肝臟、皮膚細胞等，可能主要參與皮膚，尤其毛囊及皮脂腺成熟，對局部雄激素代謝、刺激皮脂過度分泌和痤瘡的發(fā)生中有一定的作用。但在正常的的前列腺組織、頭皮毛囊雖然5α-還原酶Ⅱ表達較多，也存在一定量的5α-還原酶Ⅰ表達。同時阻斷Ⅰ型、Ⅱ型同工酶降低血清及局部組織中DHT的程度遠比單獨阻斷Ⅱ型酶強，因此同時阻斷Ⅰ型、Ⅱ型同工酶則是較好的選擇。目前已在臨床應用的雙重5α-還原酶抑制劑度他雄胺在用于防治前列腺增生、雄激素脫發(fā)等取得了較好療效，但也存在不同程度的不良反應，如性欲減退、勃起功能障礙等。本研究結果顯示，紅花提取物對5α-還原酶Ⅰ抑制率可達88.12%，對5α-還原酶Ⅱ抑制率可達61.65%，具有廣闊的開發(fā)前景，但其作用的有效部位還需進一步研究。

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