魏傳平

(泰山學院化學化工學院，山東泰安271000)

分子印跡結合SPR技術檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留

魏傳平

(泰山學院化學化工學院，山東泰安271000)

表面等離子體共振技術(SPR)是利用金屬薄膜的光學耦合產(chǎn)生的一種物理“光學現(xiàn)象”.可通過監(jiān)測SPR的變化，實時監(jiān)測分子間的相互作用，具有無需熒光標記等特點.分子印跡技術是制備對某一客體分子具有預定選擇性材料的過程，利用合成的聚合物內(nèi)的空穴對模板分子的“記憶效應”來實現(xiàn)對模板分子的選擇性識別.本文是以乙酰甲胺膦為模板分子制備的印跡聚合物膜(MIPS)，利用SPR傳感器進行檢測分析蔬菜中的農(nóng)藥殘留，結果表明，此種分子印跡傳感器具有較好的印跡效果和選擇性能.

表面等離子體共振傳感器;分子印跡聚合物;農(nóng)藥檢測

農(nóng)藥的種類很多，其中有機氮、有機磷殺蟲劑在環(huán)境中的半衰期相對較短，對哺乳動物的毒性相對較小，又由于價格便宜等優(yōu)點，它們占據(jù)了絕大多數(shù)市場.農(nóng)藥在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來好處的同時也造成大氣、水體、土壤的污染及在食品中的殘留［1－2］.考慮到農(nóng)藥對環(huán)境和人類健康的威脅，發(fā)展高靈敏度、高選擇性的農(nóng)藥殘留檢測方法顯得更加重要.表面等離子體共振技術(SPR)［3］，是一種不需要分離純化，且不需要標記的實時在線監(jiān)測技術.通過檢測分子間的相互作用，可以確定反應物的種類和濃度.此技術所需試樣少且無需標記，檢測的速度快、靈敏度高，被廣泛應用于食品、環(huán)境等監(jiān)測領域.分子印跡聚合物(MIP)是一種結構預先設計好的大分子人工材料，具有特殊的官能團和分子結構，對待測分子能選擇性的識別.MIP不但顯示出生物酶和抗體類似的分子選擇性，而且具有良好的化學惰性，在水和大多數(shù)有機溶劑中不溶.在本文中，我們采用原位引發(fā)自由基聚合的方法制備分子印跡聚合物.這一技術和方法對于快速檢測農(nóng)藥殘留具有一定的實用價值.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FT－SPR 100型表面等離子體共振儀(美國Thermo公司).

甲基丙烯酸(MAA，分析純)、三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM，分析純)、11－巰基十一烷酸(COOH－thiol，95%，分析純)均購于北京化學試劑公司;乙酰甲胺膦等有機磷農(nóng)藥(百靈威公司).

1.2 實驗方法

我們利用原位引發(fā)聚合法來制備分子印跡傳感器［4］，其原理如下:在傳感裝置的表面涂上含有單體、模板分子、引發(fā)劑的混合溶液，將其放在紫外燈下使混合溶液引發(fā)聚合，從而在傳感裝置表面上形成分子印跡膜.這一方法是較為理想的制備方案.金載玻片，作為傳感器芯片浸在10mL的新制備的Piranha溶液中2分鐘，取出傳感器芯片并用大量的蒸餾水沖洗，用N2吹干待用.然后將其放置在4℃的11－巰基十一酸的乙醇溶液中，反應24小時.依次用乙醇和蒸餾水沖洗傳感器芯片，然后將其轉入2－乙基－5－苯基異惡唑－3－磺酸的水溶液中30分鐘.最后，將該芯片轉移到10mL光引發(fā)劑ABAH的水溶液中，并保持在20℃的條件下反應3小時.引發(fā)劑覆蓋的金載玻片在N2氣流下進行干燥，并立即用于制備聚合物.將處理過的傳感芯片放到溶有模板分子乙酰甲胺膦、單體MAA和交聯(lián)劑TRIM的乙腈溶液中，通氮氣20分鐘，密封瓶口.在365nm的紫外燈照射下4°C反應2h.非印跡聚合物膜(NIP)的制備方法不加乙酰甲胺膦，其它步驟同上述.傳感芯片安裝到SPR儀器時，用洗液進行沖洗，除去未反應的混合物及模板分子.將新鮮黃瓜和油菜洗凈切成均勻的小塊，這兩種樣品的處理如下:將10g黃瓜或20g油菜樣品冷凍干燥處理24小時，然后加入標準量的乙酰甲胺膦，在研缽中加入聚乙烯聚吡咯烷酮研磨將混合物混合均勻，放置1小時后，將混合物置于離心管中，用丙酮萃取，離心20分鐘，重復提取兩次，合并提取液，蒸發(fā)至接近干燥，將殘余物重新溶解在100ml的緩沖液中，將溶液過濾備用.在實驗中，F(xiàn)TSPR測定均采用SPR－100共振儀.不同濃度測試化合物溶解于緩沖液中，進入到流動池中，直到波數(shù)位移達到穩(wěn)定值，用FT－SPR實時記錄波數(shù)的變化.

2 結果與討論

2.1 印跡聚合物膜厚度的影響

印跡膜的厚度決定了SPR傳感器響應的快慢.圖1是聚合上非印跡膜及印跡膜后的芯片和裸芯片在緩沖液中的光譜圖.由圖1可知，裸芯片與印跡聚合物膜結合后，波數(shù)紅移了929.02cm－1結合上非印跡聚合物膜后，波數(shù)紅移了228.96cm－1，這表明在SPR傳感器表面形成了非印跡和印跡薄膜.據(jù)Corn和Weibel的報道［5］，在最優(yōu)化角度處，膜厚度可通過波數(shù)的位移來計算.以此結論為依據(jù)估算的SPR芯片上結合的MIP和NIP涂層厚度分別約為22nm和5nm.非印跡膜比印跡膜要薄很多，這可能是因為在實驗過程中引發(fā)劑不同的反應方式引起的.

圖1 室溫下，在pH=5.0，0.1 mol/L HAc－NaAc緩沖液中，非分子印跡膜、分子印跡膜修飾的傳感器及裸金片的FT－SPR光譜

2.2 pH值對SPR傳感器的影響

我們將pH值對分子印跡的SPR傳感器親和性的影響進行了研究，通過改變?nèi)芤涸?.0－8.0之間的pH值，所得到的結果如圖2，從圖中可以看出，當溶液的pH從3.0增加到5.0時，分子印跡膜吸附分析物有機膦的量逐漸增加，在pH等于5.0時對有機膦的吸附量達到最大.但是當pH增到8.0時，分子印跡膜對被分析物有機膦的吸附量卻減少了.我們推測變化的原因之一是乙酰甲胺膦通過氫鍵結合到分子印跡膜的印跡位點上.基于功能單體MAA及其聚合物的pKa值我們推斷，分子印跡聚合物的等電點可能在pH值為5時.在pH=5時分子印跡膜更靠近于SPR傳感器表面，分子印跡位點上功能團的位置與模板分子在形狀、大小上更加匹配.所以，在試驗中我們將溶液的pH均調(diào)在5.0處.

圖2pH值對分子印跡的SPR傳感器的影響

2.3 印跡聚合物對SPR傳感器靈敏度的影響

我們通過實驗比較了分子印跡膜與非分子印跡膜作為傳感膜的性能.對不同濃度乙酰甲胺膦的印跡效果通過SPR的波數(shù)位移得到比較，見圖3.與非印跡芯片相比印跡傳感器芯片表現(xiàn)出較大的波數(shù)位移.對于乙酰甲胺膦分子印跡傳感器芯片，當乙酰甲胺膦的濃度為2×10－11mol/L時SPR波數(shù)變化達到最大值，盡管非印跡傳感器芯片也檢測到乙酰甲胺膦的濃度，由于其靈敏度較低，導致SPR波數(shù)的變化較小隨著乙酰甲胺膦濃度的變化.在圖3中，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)SPR傳感器對乙酰甲胺膦在一定的濃度范圍內(nèi)有很好的線性關系.然而，對于非印跡傳感器只有較差的線性度.這是由于印跡傳感器芯片對乙酰甲胺膦存在較好的特異性吸附.模板分子乙酰甲胺膦與結合位點的結合常數(shù)可以通過Langmuir等溫模型［6］求得，結合常數(shù)為7.6×1012L/mol，有這一數(shù)值更進一步說明分子印跡膜對乙酰甲胺膦具有更高的靈敏性和選擇性.

圖3 乙酰甲胺膦的濃度引起印跡及非印跡SPR傳感器波數(shù)的變化

2.4 分子印跡聚合物SPR傳感器的應用

利用分子印跡聚合物SPR傳感器分析實際樣品中乙酰甲胺膦的含量，基于圖3，對樣品中的乙酰甲胺膦含量進行了測定.表1表明，該方法表明黃瓜中乙酰甲胺膦的回收率為97.1%，而在油菜中的回收率是95.8%.再根據(jù)信噪比為3時，黃瓜和油菜的檢出限為2.96×10－13mol/L和4.26×10－14mol/L.結果表明，該方法與其他方法相比具有良好的重現(xiàn)性和高靈敏性.

表1 黃瓜和油菜樣品的分析結果(n=6)

3 小結

通過在傳感芯片表面鏈接光引發(fā)劑制得的分子印跡膜，結合分子印跡與SPR聯(lián)用技術，對實際果蔬樣品黃瓜和油菜中的乙酰甲胺膦進行了檢測.結果證明乙酰甲胺膦分子印跡SPR傳感器對于乙酰甲胺膦的檢測是一種簡單高效的方法.

［1］C.M.Torres，Y.Pico，J.Manes.Determination of pesticide residues in fruit and vegetables［J］.J.Chromatogr A，1996(754):301－331.

［2］P.Lea，F(xiàn).Mladen.Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor［J］.Biosens Bioelectron，2003(18):1－9.

［3］B.Lieberg，C.Nylander，I.Lundstrom.Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing［J］.Sensors and Actuators，1983(4): 299－304.

［4］L.K.Ista，S.Mendez，V.H.Pérez－Luna，G.P.López.Synthesis of poly(N－isopropylacrylamide)on initiator－modified self－assembled monolayers［J］.Lagmuir，2001(17):2552－2555.

［5］R.M.Corn，S.C.Weibel.Fourier transform surface plasmon resonance［M］.New York:Wiley－Interscience，2001.

［6］R.Mazel.Principles of adsorption and reaction on solid surfaces［M］.New York:Wiley－Interscience，1996.

Pesticide Residues Detection in Vegetables Using Molecular Imprinting Technique Combined with SPR

WEI Chuan－ping
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The technology of surface plasmon resonance(SPR)is a kind of physical optical phenomena generated by the optical coupling of metal thin film.By monitoring the changes of SPR，real－time monitoring the intermolecular interaction，has no need of fluorescent labeled.Molecular imprinting is a method that can prepare polymer material with predetermined selectivity towards a certain guest molecule.The selective recognition of molecularly imprinted polymers to the template molecules is obtained through the"memory effect"of the cavities formed during the polymerization process.This paper is based on the explanation of acephate template molecularly imprinted membrane(MIPS)，and then uses the SPR sensor for residue analysis of pesticides in vegetables detection.The satisfactory results were obtained.

surface plasmon resonance sensor;molecular imprinted polymer;pesticide detection

O631;TS207

A

1672－2590(2015)06－0090－04

2015－10－08

泰山學院青年教師科研基金項目(T12QK07)

魏傳平(1977－)，女，山東萊蕪人，泰山學院化學與化工學院助教.