李卓，曾漢玉，馬櫻，劉媛，張戎，劉美寧，陳麗華

2種檢測人腎綜合征出血熱IgG抗體ELISA試劑盒的比較

李卓，曾漢玉，馬櫻，劉媛，張戎，劉美寧，陳麗華

目的探討國產(chǎn)與進(jìn)口人腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）IgG抗體ELISA檢測試劑盒的性能差異。方法采用國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒分別檢測50例HFRS疫苗接種者血清樣本中抗人HFRS IgG抗體含量，分析比較2種ELISA試劑盒的一致性、靈敏性、精密度以及方法學(xué)等的差異。結(jié)果2種ELISA試劑盒的精密度良好，批內(nèi)變異系數(shù)均＜5%；2種試劑陽性一致率為100%，陰性一致率為20%，相似率為60%；靈敏性檢測結(jié)果顯示，2種ELISA試劑盒的靈敏性差異較大（P＜0.05），國產(chǎn)ELISA試劑盒的靈敏度約是進(jìn)口ELISA試劑盒的5倍。結(jié)論國產(chǎn)人HFRSIgG抗體ELISA檢測試劑盒靈敏性好，進(jìn)口ELISA試劑盒特異性好，國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒的精密度均良好，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況合理選用。

漢坦病毒；腎綜合征出血熱；抗體；酶聯(lián)免疫吸附測定

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一種由漢坦病毒感染引起，以發(fā)熱、出血和急性腎損傷為特征的急性傳染病，90%以上病例發(fā)生在中國[1]，病死率為0.1%～10%[2]，是我國亟待控制的急性傳染病之一。該病毒在我國流行的血清型主要是Ⅰ型［漢灘病毒（Hantaan virus, HTNV）］和Ⅱ型［漢城病毒（Seoul virus,SEOV）］[3-4]，分別是我國姬鼠型和家鼠型疫區(qū)的主要流行毒株[5]。此病是一種自然疫源性傳染病，四季均可散發(fā)，每年11月至次年1月是其高發(fā)季節(jié)。我國對重點(diǎn)疫區(qū)的健康人群免費(fèi)接種HFRS疫苗[6]，通常應(yīng)用ELISA法檢測HFRS抗體的產(chǎn)生情況來評價(jià)疫苗的接種效果[7]。ELISA法以其靈敏、特異、簡便等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[8-9]，但不同試劑盒的檢測性能有所差異。本研究對國產(chǎn)和進(jìn)口人HFRS抗體ELISA檢測試劑盒的性能進(jìn)行了比較，旨在為臨床疾病的診斷和疫苗免疫效果的監(jiān)測提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料50份血清樣本來自陜西省乾縣HFRS疫苗接種者。

1.2 主要試劑和儀器人HFRS抗體檢測試劑盒（ELISA法）（以下簡稱國產(chǎn)ELISA試劑盒）由上海市西唐生物科技有限公司生產(chǎn)；漢坦病毒IgG/IgM ELISA檢測試劑盒（以下簡稱進(jìn)口ELISA試劑盒）由德國IBL公司原裝進(jìn)口；HFRS抗體檢測試劑盒（膠體金法）（以下簡稱膠體金法試劑盒）由廈門市波生生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。檢測儀器為美國BIO-RADModel550型酶標(biāo)儀。

1.3 檢測方法按照各種檢測試劑盒的使用說明書操作。國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒的基本操作流程：稀釋血清、加樣、洗滌、加酶結(jié)合物、洗滌、顯色、終止后自動酶標(biāo)儀讀值以及判定結(jié)果。膠體金法試劑盒基本操作流程：稀釋血清、加樣以及判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。列四格表，計(jì)算相應(yīng)的指標(biāo)。組間滴度差異性檢驗(yàn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒一致性按照國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒對陰性和陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，在50份標(biāo)本中，2種試劑盒檢測HFRS IgG抗體結(jié)果均為陽性的標(biāo)本有25份，均為陰性的標(biāo)本有5份。國產(chǎn)試劑盒相對于進(jìn)口試劑盒陽性一致率為100%，陰性一致率為20%，相似率為60%（表1）。

表1 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 1 Consistency between domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody (sam ples)

2.2 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒靈敏性比較HFRS疫苗接種者HFRS IgG抗體陽性血清倍比稀釋后分別用國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，按照2種試劑盒各自的判斷標(biāo)準(zhǔn)，選取最大稀釋比例的陽性孔作為其檢測靈敏性的數(shù)值（表2）。結(jié)果表明，國產(chǎn)ELISA試劑盒檢測10份HFRS IgG抗體陽性樣本的滴度大約高于進(jìn)口ELISA試劑盒的5倍，說明國產(chǎn)ELISA試劑盒的靈敏性優(yōu)于進(jìn)口ELISA試劑盒。

2.3 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒精密度比較分別用國產(chǎn)和進(jìn)口同一批次ELISA試劑盒檢測1份HFRS IgG抗體陽性血清，同時(shí)做20孔，計(jì)算檢測結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)。國產(chǎn)ELISA試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)為3.3%，進(jìn)口ELISA試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)為2.4%，說明2種ELISA試劑盒精密度均較好。

2.4 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒檢測結(jié)果的一致性

2.4.1 國產(chǎn)ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性按照國產(chǎn)ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒對陰性和陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，在50份標(biāo)本中，2種方法檢測HFRS IgG抗體結(jié)果均為陽性的標(biāo)本有33份，均為陰性的標(biāo)本有5份。國產(chǎn)ELISA試劑盒相對于膠體金法試劑盒陽性一致率為100%，陰性一致率為29%，相似率為76%（表3）。

表2 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒檢測結(jié)果的靈敏性比較（滴度）Table 2 Com parison of the detection sensitivity obtained w ith the domestic and im ported ELISA kits(titer)

表3 國產(chǎn)ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 3 Consistency between the domestic ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(sam ples)

2.4.2 進(jìn)口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性按照進(jìn)口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒對陰性和陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，在50份標(biāo)本中，2種方法檢測HFRS IgG抗體結(jié)果均為陽性的標(biāo)本有25份，均為陰性的標(biāo)本有17份。進(jìn)口ELISA試劑盒相對于膠體金法試劑盒陽性一致率為76%，陰性一致率為100%，相似率為84%（表4）。

2.5 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒的方法學(xué)比較見表5。

3 討論

當(dāng)人體感染漢坦病毒或接種HFRS疫苗后不久，在血清中就可檢測到HFRS抗體，最早產(chǎn)生的是HFRS IgM抗體，在7～10 d達(dá)到高峰，HFRS IgG抗體在發(fā)病大約2周時(shí)出現(xiàn)，可持續(xù)數(shù)年。檢測HFRS IgM抗體常用于疾病的早期診斷，檢測HFRS IgG抗體對于HFRS的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和疫苗接種效果監(jiān)測具有重要意義[10]。HFRS抗體檢測的方法有多種，如間接免疫熒光、ELISA、膠體金法和免疫組化法等。ELISA法因其靈敏、特異、簡單、穩(wěn)定和易于自動化操作等特點(diǎn)，成為實(shí)驗(yàn)室檢測病毒感染和血清抗體的主要方法之一，也是臨床檢驗(yàn)科檢測HFRS的常用方法。市面銷售有多種國產(chǎn)和進(jìn)口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒，有必要對其檢測性能進(jìn)行比較研究。本研究比較上海西唐生物科技有限公司和德國IBL公司原裝進(jìn)口的HFRS抗體ELISA檢測試劑盒，分別用2種試劑盒檢測50份HFRS疫苗接種者血清標(biāo)本的HFRSIgG抗體，一致性比較結(jié)果顯示二者的相似率為60%。2種試劑盒陽性檢出率有明顯差異，國產(chǎn)ELISA試劑盒陽性檢出率為90%，進(jìn)口ELISA試劑盒陽性檢出率為50%。將HFRSIgG抗體陽性血清連續(xù)進(jìn)行倍比稀釋后進(jìn)行2種試劑盒的靈敏度檢測，結(jié)果表明國產(chǎn)HFRS試劑盒的靈敏度約是進(jìn)口HFRS試劑盒的5倍。2種試劑盒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不同，國產(chǎn)HFRS試劑盒以P/N（標(biāo)本O.D值/陰性對照O.D值）≥2.1為陽性，進(jìn)口試劑盒以Q（標(biāo)本O.D值/參照質(zhì)控O.D值）＞1.5為陽性。這些方法學(xué)的差異可能導(dǎo)致了國產(chǎn)ELISA試劑盒與進(jìn)口ELISA試劑盒的檢出率和靈敏度差異較大。

表4 進(jìn)口ELISA試劑盒和膠體金法試劑盒檢測HFRS IgG抗體的一致性(份)Table 4 Consistency between the im ported ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody(samples)

表5 國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒的方法學(xué)比較Table 5 Comparison of themethodology between the domestic and im ported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明國產(chǎn)ELISA試劑盒的陽性檢出率高于進(jìn)口ELISA試劑盒，這可能與國產(chǎn)ELISA試劑盒采用SPA替代抗人IgG抗體有關(guān)。既往實(shí)驗(yàn)表明，SPA替代抗人IgG抗體有如下特點(diǎn)：SPA制備容易，性質(zhì)穩(wěn)定，易于純化，能應(yīng)用于人和多種哺乳動物的IgG，不受種屬限制，可制成通用試劑，價(jià)格較低廉，而抗人IgG抗體的制備須多次免疫動物，在應(yīng)用上要受同種屬的限制[11]；SPA的結(jié)合力強(qiáng)，相當(dāng)于游離抗體與抗原的結(jié)合力，結(jié)合后對IgG的活性無影響[12]；SPA無論在0、37、44、56℃均能立即與IgG結(jié)合而無需長時(shí)間孵育，因此可以縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間[13]，且不易出現(xiàn)抗人IgG抗體長時(shí)間孵育過程中出現(xiàn)的抗原抗體解離的問題；但SPA除與IgG結(jié)合外，還能與血清中少量的IgM和IgA結(jié)合。鑒于此，SPA現(xiàn)已廣泛用于ELISA試劑盒的建立，如國內(nèi)已建立檢測狂犬病病毒抗體的SPA ELISA試劑盒[14]、檢測冠狀病毒抗體的SPA ELISA試劑盒[15]以及用于檢測弓形蟲抗體的ELISA試劑盒[16]等。

分別用國產(chǎn)和進(jìn)口同一批次ELISA試劑盒進(jìn)行精密性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算檢測結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明國產(chǎn)和進(jìn)口ELISA試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，2種試劑盒的精密度均較好，意味著2種試劑盒檢測的重復(fù)性好。

膠體金層析技術(shù)作為一門成熟的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)，近年來已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和免疫抗體的監(jiān)測[17-18]，方法簡便、快速、不受條件限制，很適用于基層業(yè)務(wù)單位使用。據(jù)報(bào)道用于檢測EHF IgG抗體的膠體金法靈敏度和特異度分別為94.9%和100%[19]。國產(chǎn)和進(jìn)口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒與膠體金法試劑盒的一致性比較顯示：國產(chǎn)ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的相似率為76%；進(jìn)口ELISA試劑盒與膠體金法試劑盒的相似率為84%。50份血清樣本中，膠體金法試劑盒的陽性檢出率為66%，介于國產(chǎn)與進(jìn)口ELISA試劑盒之間。造成陽性檢出率差異顯著的主要因素是方法的靈敏性、試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等。據(jù)檢測結(jié)果推測國產(chǎn)ELISA試劑盒靈敏度高，進(jìn)口ELISA試劑盒特異性強(qiáng)。試劑盒的陽性率和一致性的差異提示要根據(jù)不同目的合理地選擇試劑盒。國產(chǎn)ELISA試劑盒靈敏，價(jià)格較便宜，適用于篩選實(shí)驗(yàn)；進(jìn)口ELISA試劑盒特異性強(qiáng)，可用于確證實(shí)驗(yàn)；而膠體金法試劑盒操作簡單、檢測速度快，可用于臨床即時(shí)檢測。

綜上所述，國產(chǎn)和進(jìn)口HFRS抗體ELISA檢測試劑盒均使用雙抗體夾心ELISA法，操作步驟基本一致，精密度良好，但二者在所用的酶結(jié)合物、結(jié)果判斷方法、靈敏性、特異性、一致性和價(jià)格等方面存在較大差異，在實(shí)際使用過程中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠淼剡M(jìn)行選用。

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Com parison of two ELISA kits for the detection of the IgG antibodies against hemorrhagic fever w ith renal syndrome

LIZhuo,ZENG Han-yu,MA Ying,LIU Yuan,ZHANG Rong,LIU Mei-ning,CHEN Li-hua*
Department of Immunology,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi710032,China
*Corresponding author,E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn

Objective To investigate the performance differences in detecting hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) IgG Antibodies between domestic and imported ELISA kits.M ethods Domestic and imported ELISA kitswere used to detect HFRS IgG antibodies of the serum samples from 50 HFRS vaccinators,and the consistency,sensitivity,precision and methodology of the two ELISA kitswere analyzed.Results Precision testshowed thatboth the domestic and the imported ELISA kitshad good precision,with the batch coefficientof variation of less than 5%.The positive consistency rate of the two ELISA kitswas 100%,the negative consistency rate was 20%,and the similarity rate was 60%.The sensitivity of the domestic ELISA kitswas 5 times higher than that of the imported ELISA kits,and the differencewas significantbetween the two ELISA kits(P＜0.05).Conclusions The sensitivity of the domestic ELISA kits is higher than that of the imported ELISA kits,the specificity of the imported ELISA kits is higher than that of the domestic ELISA kits,and both the domestic ELISA kits and the imported ELISA kits have good precision for the detection of HFRS IgG antibodies.The selection and application of the domestic or the imported ELISA kits depend on specific requirements.

Hantaan virus;hemorrhagic feverwith renalsyndrome;antibodies;enzyme-linked immunosorbentassay

R373.32；R512.8

A

1007-8134(2015)02-0092-04

國家科技重大專項(xiàng)（2013ZX1004609）；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81401297）

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室（李卓、曾漢玉、馬櫻、劉媛、張戎、陳麗華）；710054，西安市衛(wèi)生學(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教研室（李卓）；712046，咸陽市疾病預(yù)防控制中心（劉美寧）

陳麗華，E-mail:chenlh@fmmu.edu.cn