劉欣欣 王中彥

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

細(xì)柱五加（Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith）為五加科（Araliaceae）五加屬植物，在我國(guó)，主要分布于湖南、湖北等地，多以根皮入藥，是常用于祛風(fēng)濕和強(qiáng)壯筋骨的傳統(tǒng)中藥。主要用于治療風(fēng)濕痹病，筋骨萎軟、小兒行遲，體虛乏力等癥[1]。

多糖是指由10個(gè)或10個(gè)以上單糖聚合而成的一類(lèi)生物大分子。研究發(fā)現(xiàn)多糖不僅具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗衰老等多方面藥理活性[2]，而且對(duì)物理的、化學(xué)的及生物來(lái)源的多種活性氧簇（ROS）具有良好的清除作用，能抑制UV所導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化、減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成，抑制體外H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血[3-9]，增加超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px ）活性等[10]，使多糖具有較好的抗氧化活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑腫瘤、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[11]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)[12-13]。加之多糖本身低毒、來(lái)源廣泛，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

采用正交試驗(yàn)來(lái)確定細(xì)柱五加多糖超聲提取的最佳工藝，以期為細(xì)柱五加多糖藥物及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 材料：細(xì)柱五加（Eleutherococcus nodiflorus（Dunn）S. Y.Hu ）購(gòu)于江蘇省盱眙中藥飲片廠。

1.2 試劑：D-無(wú)水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）。濃硫酸、鋁片、苯酚、95%乙醇等所用試劑均為分析純。

UV-1700型分光光度計(jì)（日本島津公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BüCHI公司）；KQ-500DE 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）；FSD-100型電動(dòng)粉碎機(jī)（杭州托普儀器有限公司）；DSY-1-4孔電熱恒溫水浴鍋（北京愛(ài)琦霞商貿(mào)有限公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市英予華儀器廠），Labconco FreeZone冷凍干燥儀（美國(guó)LABCONCO 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備：取在105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖202.7 mg，精密稱(chēng)定，加純水溶解并定容至100 mL，作為母液備用。再取適量母液稀釋至質(zhì)量濃度為0.203 mg/mL的葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 苯酚溶液的配制：稱(chēng)取苯酚200 g，加入鋁片0.2 g和碳酸氫鈉0.1 g，進(jìn)行蒸餾，收集182 ℃餾分，精密稱(chēng)取25.0 g餾分，用純水溶解，并于棕色瓶中定容至500 mL，即得5%苯酚溶液，于4 ℃溫度下避光保存?zhèn)溆谩Ｒ?jiàn)圖1。

圖1 多糖的提取工藝流程

2.3 多糖的提取工藝流程：①預(yù)處理：將材料洗凈、烘干，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，加入乙醚浸泡12 h，揮干乙醚，殘?jiān)?5%的乙醇回流2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑，保存?zhèn)溆谩＂趕evag法脫蛋白：沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醇洗滌至無(wú)色，再加水復(fù)溶，按1∶1的比例用水復(fù)溶，置錐形瓶中，加入其體積1/4的sevag試劑[三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（v∶v）的混合溶液]劇烈震搖15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液再加入相當(dāng)于其體積 1/4 的sevag試劑，重復(fù)以上操作直到無(wú)白色絮狀物產(chǎn)生為止。濃縮，真空冷凍干燥，即得。

2.4 粗多糖含量測(cè)定。式（1）中：C為測(cè)得的樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為供試液體積/mL；m為供試品的質(zhì)量/mg；式（2）中：m為醇沉后得到的多糖質(zhì)量/g；M為稱(chēng)取的細(xì)柱五加的質(zhì)量/g。

2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：精密吸取0.5 mL葡萄糖對(duì)照品溶液和2.0 mL供試品溶液于具塞試管中，各加入5%苯酸1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置5 min，再于100 ℃水中保溫15 min，取出，室溫放冷，在200～600 nm處進(jìn)行掃描，對(duì)照品和供試品在490 nm處有最大吸收波長(zhǎng)（波長(zhǎng)掃描光譜圖，見(jiàn)圖2）。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察：取6個(gè)具塞試管，分別加入對(duì)照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μL，精密吸取，加純水至2 mL，以純水為空白，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置5 min，再于100 ℃水中保溫15 min，取出，室溫放冷，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的葡萄糖溶度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為：A= 0.0092C+0.1084，r=0.9990，在30.41～81.08 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)表1和圖3。

圖2 200～600 nm波長(zhǎng)吸光度譜圖

表1 葡萄糖線(xiàn)性關(guān)系考察

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.7 單因素試驗(yàn)：考察不同提取方式、溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度對(duì)細(xì)柱五加多糖提取率的影響。

2.7.1 提取方式考察：準(zhǔn)確稱(chēng)取細(xì)柱五加藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）10.0 g，置于提取容器中，加入純水100 mL，密塞，稱(chēng)定重量，分別60 ℃環(huán)境下熱浸、超聲60 min，再稱(chēng)定重量，用純水不足減失的重量，搖勻，過(guò)濾。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖。結(jié)果表明：超聲能夠加速藥材中多糖溶解于溶劑中，使得提取粗多糖得率較高，因此選用超聲提取方法。見(jiàn)圖4。

圖4 提取方式對(duì)多糖提取率的影響

2.7.2 溶劑用量對(duì)多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g細(xì)柱五加藥材（過(guò)三號(hào)篩），超聲提取，提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60 ℃，提取次數(shù)為1次。分別加入純水50、100、150、200、250 mL。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖。隨著溶劑用量的增加，多糖提取率也隨著提高，達(dá)到150 mL后趨于緩慢。因此確定溶劑用量為150 mL。見(jiàn)圖5。

2.7.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取溫度為60 ℃，每次提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，隨提取時(shí)間的增加，多糖提取率也增加，這是超聲波提取過(guò)程時(shí)原料中多糖成分不斷溶出并向提取液中擴(kuò)散的過(guò)程。隨著提取時(shí)間的增加，提取溶劑中多糖的含量逐漸增大，而同時(shí)原料組織中，多糖含量逐漸降低，則多糖物的濃度梯度不斷減少，至趨近于平衡，所以在90 min后多糖提取率增加較緩慢。綜合考慮，提取時(shí)間選擇90 min。見(jiàn)圖6。

圖5 提取溶媒用量對(duì)多糖提取率的影響

圖6 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.7.4 不同提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次、5次。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，細(xì)柱五加多糖提取率隨著提取次數(shù)的增加而增加，由多次造成藥材細(xì)胞內(nèi)外多糖的濃度差，使細(xì)胞內(nèi)的多糖不斷向外擴(kuò)散，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)多糖幾乎完全溶出，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從圖可以看出當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3 次時(shí)，再增加提取次數(shù)，多糖提取率增大的幅度不大，而且消耗時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，工作量加大，從經(jīng)濟(jì)等多方面綜合考慮，選擇最佳提取次數(shù)為3次。見(jiàn)圖7。

圖7 不同提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

2.7.5 提取溫度對(duì)多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g藥材，加入純水150 mL，提取時(shí)間為90 min，提取次數(shù)為3次，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃。按“多糖的提取工藝流程”操作制得粗多糖，在60 ℃之前，隨著溫度的升高，多糖溶出率增加，提取率隨溫度的升高而增加；在60 ℃后，多糖提取率隨溫度的增加而降低，可能是因?yàn)闇囟雀?，在超聲的空化作用和高溫的雙重作用下使得多糖降解，從而使提取率降低。所以，提取溫度選擇60 ℃較為適宜。見(jiàn)圖8。

2.8 正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用 L9（34） 正交表，選取溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度為考察因素（表2），并選擇適當(dāng)?shù)囊蛩厮椒秶瑢?duì)多糖提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3、4。

由表3直觀分析表明，用超聲法提取多糖選擇水為溶劑，以多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最優(yōu)提取工藝為準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g藥材超聲提取，純水200 mL、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)4次。各因素對(duì)提取率的影響程度依次是提取次數(shù)＞溶劑用量＞提取時(shí)間＞提取溫度。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果

圖8 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

表2 L9（34） 正交試驗(yàn)因素水平表

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：對(duì)比單一因素和正交實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，分別按優(yōu)化后的工藝條件，重復(fù)3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正交實(shí)驗(yàn)給出的最優(yōu)提取工藝對(duì)細(xì)柱五加多糖的平均提取率為6.54%，結(jié)果表明優(yōu)化得到提取工藝穩(wěn)定且多糖提取量最大。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定細(xì)柱五加多糖的最佳提取、純化方法為：將材料洗凈、烘干，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，加入乙醚浸泡12 h，揮干乙醚，殘?jiān)?5%的乙醇回流2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑，保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取10.0 g處理過(guò)藥材，加入200 mL純水，超聲提取，提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)4 次。合并濾液，濃縮至料液比1∶1，加入乙醇使其醇含量為80%，靜置24 h。離心棄上清液，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌至無(wú)色，再加水復(fù)溶，按1∶1的比例用水復(fù)溶，置錐形瓶中，加入其體積1/4的sevag試劑[三氯甲烷∶正丁醇=4∶1（v∶v）的混合溶液]劇烈震搖15 min，4000 r/min離心10 min，取上清液再加入相當(dāng)于其體積 1/4的sevag試劑，重復(fù)以上操作直到無(wú)白色絮狀物產(chǎn)生為止。濃縮，真空冷凍干燥，即得。

有學(xué)者對(duì)細(xì)柱五加多糖做了細(xì)胞毒性與體外免疫活性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示細(xì)柱五加莖多糖能刺激巨噬細(xì)胞釋放NO，具有一定的體外免疫活性[14]。且在對(duì)其同屬紅毛五加多糖的研究中發(fā)現(xiàn)其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，能抑制S180腫瘤生長(zhǎng)，表明其具有抗腫瘤作用[15]。所以對(duì)細(xì)柱五加多糖進(jìn)行深入研究，必將促進(jìn)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)人體自衛(wèi)機(jī)制的研究。

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