王海東等

摘 要 應(yīng)用電噴霧萃取電離質(zhì)譜法對(duì)慢性乙型肝炎患者（41例）及正常人（34例）的呼出氣體樣本進(jìn)行檢測(cè)，迅速獲得其一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法主成分分析（PCA）和聚類分析（CA）對(duì)所獲得的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，可有效區(qū)分患者與正常人群，且不同臨床類型慢性乙肝聚類分析圖譜有不同表現(xiàn)，此結(jié)果有助于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析。另外，本方法也為發(fā)展簡(jiǎn)單、快速、非侵入性慢性乙型肝炎臨床診斷方法提供解決思路。

關(guān)鍵詞 慢性乙型肝炎； 呼出氣體； 電噴霧萃取電離質(zhì)譜； 主成分分析； 聚類分析

1 引 言

肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺，也是體內(nèi)解毒和新陳代謝的中心。肝臟疾病有著高發(fā)病率和死亡率，病因復(fù)雜多樣，臨床可表現(xiàn)從無癥狀至嚴(yán)重的肝功能衰竭[1]。臨床醫(yī)師很早就發(fā)現(xiàn)，肝昏迷的患者呼出氣中就有一種肝臭氣味。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是分析化學(xué)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，呼出氣體檢測(cè)作為一種了解人體生理代謝過程和疾病狀況的方法備受關(guān)注[2，3]。呼出氣與常規(guī)的血液檢測(cè)方法相比，檢測(cè)的最大優(yōu)點(diǎn)是采樣簡(jiǎn)單，具有非侵入性，且樣本連續(xù)可得[4]。目前，對(duì)呼出氣研究多集中在肺部疾病和環(huán)境氣體，肝病的呼出氣研究鮮有報(bào)道。

常規(guī)的呼出氣檢測(cè)質(zhì)譜方法為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）法，而此方法需經(jīng)過復(fù)雜的前處理及色譜分離過程，難以滿足臨床診斷的快速分析。電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EESIMS）是一種新型的直接質(zhì)譜分析方法，可在無需樣品預(yù)處理?xiàng)l件下對(duì)復(fù)雜基體樣品進(jìn)行直接、快速、靈敏、高通量質(zhì)譜檢測(cè)[5，6]。與其它質(zhì)譜技術(shù)相比較，EESIMS可直接檢測(cè)患者呼出氣體，且靈敏度高、響應(yīng)速度快，能夠?qū)崿F(xiàn)呼出氣體中的痕量有機(jī)物的原位、實(shí)時(shí)、在線的分析[6＼] 。

本研究利用電噴霧萃取電離質(zhì)譜（EESIMS）技術(shù)對(duì)41例慢性乙型肝炎患者呼出氣進(jìn)行了初步分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)所獲得的指紋圖譜對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明，EESIMS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法僅依靠一級(jí)譜圖即可對(duì)慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進(jìn)行較好區(qū)分，故而對(duì)疾病的診斷和病情的判斷均有一定的臨床意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

EESI 離子源[7，8]（東華理工大學(xué)研制）；LTQXL 增強(qiáng)型線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Finnigan 公司），配有Xcalibur 數(shù)據(jù)系統(tǒng)；T2PV/L 型 5L Tedlar采樣袋（大連德霖氣體包裝有限公司）；甲醇（色譜純，SK Chemicals 公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

Tedlar采樣袋在使用前用氮?dú)馇逑?次，每次30 min， 烘干以除去可能殘留的吸附物。受試者夜間禁食、禁煙、禁酒，晨起后勿刷牙，在通風(fēng)條件良好的環(huán)境下呼吸30 min以上，在安靜狀態(tài)下向5LTedlar采樣袋內(nèi)呼氣，直至氣袋充滿為止，同時(shí)收集周圍空氣作為實(shí)驗(yàn)背景空白。呼氣樣本收集完畢后利用EESIMS在3 h內(nèi)完成所有樣本的檢測(cè)分析。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件

EESIMS分析條件：EESI離子源角度（α，β）和距離（a，b）根據(jù)以往文獻(xiàn)＼[7，8＼]優(yōu)化調(diào)節(jié)，質(zhì)譜采用正離子檢測(cè)模式，霧化氣（N2）壓力為1.2 MPa；進(jìn)樣口溫度為100℃，掃描質(zhì)量范圍50～800 Da；噴霧電壓為3. 5 kV；萃取劑甲醇溶液流速為5 μL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 41例慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體的質(zhì)譜分析

采用正離子掃描模式，在優(yōu)化的EESIMS條件下對(duì)肝病患者和健康對(duì)照組呼出氣體樣本進(jìn)行快速質(zhì)譜分析，可以得到其一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖（圖1）。從圖1可知，41例患者同對(duì)照組呼出氣體樣本在m/z 50～400范圍內(nèi)具有豐富的物質(zhì)信息，表明EESIMS能夠同時(shí)檢測(cè)到呼出氣體中的多種組分。雖然質(zhì)譜圖在m/z>400處的質(zhì)譜信號(hào)相對(duì)較低，但將指紋圖譜放大20倍后仍可獲得信噪比較高（S/N>10）的質(zhì)譜。由于呼出氣體中的揮發(fā)性標(biāo)志物含量都較低，所以在一級(jí)質(zhì)譜圖中患者與正常人的主要質(zhì)譜峰基本相同。但是，仔細(xì)觀測(cè)這些質(zhì)譜峰信號(hào)后可以發(fā)現(xiàn)仍然差別，主要體現(xiàn)在m/z 56， 74， 89， 105， 157， 201， 279， 318等質(zhì)譜信號(hào)。為了更好地區(qū)分患者與正常人的呼出氣體的差異，本研究采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3.3 慢性乙肝不同臨床類型患者的聚類分析

聚類分析（CA）是一種靜態(tài)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，它能夠?qū)⒆蛹g更細(xì)微的區(qū)別與聯(lián)系以譜系圖的方式直觀地表現(xiàn)出來，目前已廣泛應(yīng)用于模式識(shí)別和圖像分析等領(lǐng)域[17]。本實(shí)驗(yàn)將已進(jìn)行過PCA分析的慢性乙型肝炎患者與正常人呼出氣體樣本一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab軟件自帶的聚類分析程序中進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖4所示。慢性乙肝患者呼出氣體樣本為41個(gè)，正常人呼出氣體樣本為34個(gè)，從分析結(jié)果可知，1～102號(hào)樣本點(diǎn)（正常人的呼出氣體）經(jīng)軟件程序分析后自聚成一類，103～225號(hào)樣本點(diǎn)（慢性乙型肝炎患者的呼出氣體）自聚成另一類，從而說明聚類分析能夠明顯的對(duì)慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本進(jìn)行區(qū)分，這與PCA 的分析結(jié)果相印證。而在慢性乙型肝炎患者呼出氣體樣本中，又可明顯看到其一大類中又自聚成4個(gè)亞類，分析其可能原因?yàn)椋?03～171號(hào)樣本點(diǎn)的23例患者為慢性重型或重度肝炎，病情重，病情進(jìn)展較快，并發(fā)癥較多，短期內(nèi)發(fā)展成為肝衰竭；172～189號(hào)樣本點(diǎn)的6例患者診斷為肝硬化，病程長(zhǎng)至數(shù)月，患者就診時(shí)多已出現(xiàn)腹水，處于肝硬化失代償期；190～204號(hào)的5例患者來說起病較緩，病情相對(duì)較輕，結(jié)合生化檢查診斷為慢性中度乙型病毒性肝炎；205～225號(hào)的7例患者為慢性輕度乙型病毒性肝炎，臨床表現(xiàn)為食欲下降，睡眠不佳等，癥狀不明顯，生化檢查僅1～2項(xiàng)輕度異常；從慢性乙型肝炎的不同類型之間，因?yàn)楦闻K的損傷程度不同，而對(duì)所測(cè)到的物質(zhì)的代謝也有區(qū)別，表現(xiàn)形式不同，符合慢性乙型肝炎的病理生理過程。因此可能成為它們自聚成一類的原因；而本實(shí)驗(yàn)在PCA分析中未發(fā)現(xiàn)此差異，說明CA分析能夠直觀地表現(xiàn)出子集之間更細(xì)微的差別與聯(lián)系。

4 結(jié) 論

綜上所述，利用EESIMS對(duì)慢性乙型肝炎患者及正常人呼出氣體樣本進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，獲得其一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中主成分分析法（PCA）和聚類分析法（CA）對(duì)所獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，僅一級(jí)譜圖即可將慢性乙型肝炎患者及正常人的呼出氣體樣本快速、靈敏、準(zhǔn)確地區(qū)分開來，且對(duì)于臨床不同類型慢性乙型肝炎輕和重也有區(qū)別。這個(gè)結(jié)果對(duì)于慢性乙型肝炎的臨床診斷和病情分析有一定的幫助，此方法也為簡(jiǎn)單、快速、非侵入性臨床診斷方法的開發(fā)提供一種思路。但本研究樣本量較少，部分區(qū)別的物質(zhì)還未能確定，還需進(jìn)一步深入的研究。

References

1 Probert S J， Ahmed I， Khalid T， Johns0n E， Smith S， Ratcliffe N. Gastrointestin Liver Dis.， 2009， 18（3）： 337-343

2 Michael M， Cullinane C， Hatzimihalis A， O′Kane C， Milner A， Booth R， Schlicht S， Clarke S J， Francis P. Cancer Chemother. Pharmacol.， 2012， 69： 125-135

3 Schubert R， Schwoebel H， MauMoeller A， Behrens M， Fuchs P， Sklorz M， Schubert J K， Bruhn S， Miekisch W. Metabolomics， 2012： 1-12

4 Li M， Ding J H， Gu H W， Zhang Y， Pan S S， Xu N， Chen H W， Li H M. Scientific Reports， 2013， （3）： 1205

5 HU Bin， YUE Hao， HUANG KeKe， JIANG CuiCui， LIU ShuYing， FEI Qiang， CHEN HuanWen. Chem. J. Chinese Universities， 2011， 32（6）： 1289-1294

胡 斌， 越 皓， 黃科科， 姜翠翠， 劉淑瑩， 費(fèi) 強(qiáng)， 陳煥文. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 32： 1289-1294

6 Law W S， Wang R， Hu B， Berchtold C， Meier L， Chen H W， Zenobi R. Anal. Chem.， 2010， 82（11）： 4494-4500

7 Chen H W， Wortmann A， Zhang W H， Zenobi R. Angew. Chem. Int. Ed.， 2007， 46， 580-583

8 Ding J H， Yang S P， Liang D P， Chen H W， Wu Z Z， Zhang L L， Ren Y L. Analyst， 2009， 134（10）： 2040-2050

9 Wu Z C， Chingin K， Chen H W， Zhu L， Jia B， Zenobi R. Anal. Bioanal. Chem.， 2010， 397（4）： 1549-1556

10 ZHU ZhiQiang， YAN JianPing， WANG Yu， CHEN ShunZong， CHEN HuanWen. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（6）： 905-910

朱志強(qiáng)， 閆建平， 汪 雨， 陳瞬宗， 陳煥文. 分析化學(xué)， 2013， 41（6）： 905-910

11 Khalid T Y， Costello B D L， Ewen R， White P， Stevens S， Gordon F， Collins P， McCune A， Shenoy A， Shetty S， Ratcliffe N M， Probert C S. Metabolomics， 2013， 9： 938-948

12 Alkhouri N， Cikach F， Eng K， Moses J， Patel N， Yan C， Hanouneh I， Grove D， Lopez Rocio， Dweik R. Eur. J. Gastroent. Hepat.， 2014， 26（1）： 82-87

13 van den Velde S， Nevens F， Van hee P， van Steenberghe D， Quirynen M. J. Chromatogr. B， 2008， 875（2）： 344-348

14 Otsuka M， Mine T， Ohuchi K， Ohmori S. J. Biochem.， 1996， 119（2）： 246-251

15 Vlkel W， Wolf N， Derelanko M， Dekant W. Toxicol. Sci.， 1999， 47（2）： 144-150

16 Qin T， Liu H， Song Q， Song G， Wang H Z， Pan Y Y， Xiong F X， Gu K S， Sun G P， Chen Z D. Cancer Epidemiology Biomar. Prev.， 2010， 19： 2247-2253

17 Chen H W， Liang H Z， Ding J H， Lai J H， Huan Y F， Qiao X L. J. Agric. Food Chem.， 2007， 55： 10093-10100