劉志勤，任婧婧，張衛(wèi)萍，杜晶晶，賈曉濤，王新來

論著·臨床

漢族急性缺血性腦卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的多因素分析

劉志勤，任婧婧，張衛(wèi)萍，杜晶晶，賈曉濤，王新來

目的 分析漢族急性缺血性腦卒中患者CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的關(guān)系。方法 2012年7月—2014年9月連續(xù)性納入住院并服用氯吡格雷抗血小板聚集治療(75 mg/d，連續(xù)>7 d)的急性缺血性腦卒中患者72例。根據(jù)對二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率將患者分為氯吡格雷抵抗(CR)組(27例)和非抵抗(NCR)組(45例)?；蛐酒z測受試者的CYP2C19基因型，依據(jù)突變類型，分為快代謝型(*1/*1)、中間代謝型(*1/*2、*1/*3)和慢代謝型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)。采用多元Logistic回歸分析篩選與發(fā)生氯吡格雷抵抗相關(guān)的危險因素。結(jié)果 2組CYP2C19基因型的分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.302，P<0.05)；檢出CYP2C19基因型為慢代謝型7例(9.7%)，中間代謝基因型39例(54.2%)，快代謝型26例(36.1%)；3組的血小板聚集抑制率分別為(67.5±21．6)%、(57．6±23．4)%和(31.4±15.1)%，慢代謝型>中間代謝型>快代謝型(P<0.01)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示CYP2C19慢代謝型(*2/*2、*2/*3)(OR=7.802，95%CI 1.412～40.304,P=0.018)和低密度脂蛋白水平>2.6 mmol/L(OR=3.923，95%CI 1.314～17.927,P=0.032)是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險因素。結(jié)論 漢族急性缺血性腦卒中患者中，CYP2C19慢代謝基因型(*2/*2、*2/*3)和低密度脂蛋白水平升高是導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險因素。

CYP2C19基因多態(tài)性；氯吡格雷；抵抗；多因素分析

氯吡格雷目前被廣泛應(yīng)用于預(yù)防高危卒中的復(fù)發(fā)，我國缺血性卒中治療指南都明確提出：對于非心源性缺血性卒中患者的二級預(yù)防，氯吡格雷可作為單用或聯(lián)合用藥的選擇[1]；但研究發(fā)現(xiàn)，在接受規(guī)范氯吡格雷治療的缺血性卒中患者中，每年仍有不少卒中再發(fā)事件[2]，氯吡格雷抵抗(CR)是指氯吡格雷用于部分缺血性疾病患者時其抗血小板聚集作用降低或消失，患者仍發(fā)生血栓事件的現(xiàn)象。目前的研究認(rèn)為，氯吡格雷體內(nèi)相關(guān)過程蛋白細(xì)胞色素 P450基因多態(tài)性是導(dǎo)致氯吡格雷抵抗發(fā)生的重要因素,其CYP2C19*2和CYP2C19*3突變是漢族人群的主要突變類型[3]。氯吡格雷抵抗可能與基因多態(tài)性等多種因素相關(guān)，但尚無定論，本研究旨在考察漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者氯吡格雷抵抗的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012年7月—2014年9月西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診的急性缺血性腦卒中患者72例，均符合中國急性缺血性卒中診治指南認(rèn)定的急性腦梗死標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中男52例，女20例，年齡35～76(64.8±9.6)歲。發(fā)病時間7～14 d。根據(jù)對二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率將患者分為氯吡格雷抵抗(CR)組和非抵抗(NCR)組。CR組27例，NCR組45例。2組患者一般臨床特征詳見表1。

表1 CR與NCR組主要基線特征的比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲；②依據(jù)中國急性缺血性卒中診治指南認(rèn)定的急性腦梗死患者；③連續(xù)服用氫氯吡格雷(波立維)75 mg≥7 d；④簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①血小板計數(shù)(PLT) < 100×109/L ；②近1個月內(nèi)有應(yīng)用其他抗血小板聚集藥物或抗凝藥物史；③近3個月內(nèi)有活動性出血史，或伴有出血性血液病、惡性腫瘤等；④嚴(yán)重肝、腎功能異常: 超過正常上限的50%； ⑤近1個月內(nèi)有外科大手術(shù)史；⑥同時應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑類藥物的患者。

1.3 藥物治療 所有患者均口服氯吡格雷(賽諾菲安萬特制藥有限公司生產(chǎn))75 mg/d，連續(xù)使用7 d以上，患者入組后均聯(lián)用阿托伐他汀(輝瑞制藥公司生產(chǎn))20 mg/d。所有患者同時給予依達(dá)拉奉注射液(吉林博大制藥公司生產(chǎn))30 mg靜脈注射，2次/d,連續(xù)治療14 d。其余治療依據(jù)中國腦血管病急性期治療指南對癥處理。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 基線資料： 記錄入選患者的人口學(xué)特征、用藥情況，既往史(高血壓、卒中、房顫、糖尿病、高脂血癥)，血壓，血糖，NIHSS評分，磁共振血管成像(MRA)、數(shù)字減影血管造影(DSA)等血管學(xué)檢查，卒中TOAST分型，合并用藥情況。

1.4.2 血小板聚集功能測定： 連續(xù)服用氯吡格雷75 mg/d，7 d后，抽取空腹肘靜脈血3 ml(抗凝血)，采用光學(xué)比濁法血小板聚集試驗測定血小板聚集率，采用美國HELENA四通道血小板聚集儀和誘導(dǎo)ADP(50 μmmol/L，美國Sigma公司)分別在氯吡格雷服藥前、服藥后10～14 d時測定小板聚集率。要求在送檢后3 h內(nèi)完成。參照Gurbel等[5]提出的氯吡格雷抵抗評價標(biāo)準(zhǔn)：以服用氯吡格雷前后ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率的差值≤10%判定氯吡格雷抵抗。

1.4.3 基因型檢測： 采集受試者3 ml靜脈血EDTA抗凝管-20℃保存，集中DNA提取和基因檢測。CYP2C19基因型檢測采用西安金磁納米科技有限公司CYP2C19基因檢測試劑盒(PCR-金磁微粒層析法，試劑型號：REF0011)。操作(AS-PCR法)[6]：制備樣本DNA，準(zhǔn)備聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，雜交顯色。反應(yīng)結(jié)束后，取出芯片，將芯片放入生物芯片識讀儀中，用基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析，輸出檢測結(jié)果。最終輸出6種基因型：*1/*1 基因型為快代謝型，*1/*2 或*1/*3 基因型為中間代謝型，*2/*2、 *3/*3 或*2/*3 基因型為慢代謝型[7]。

2 結(jié) 果

2.1 不同基因型分布比較 通過對CR組與NCR組CYP2C19基因型構(gòu)成比統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，2組間基因型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.302，P<0.05)，見表2。

2.2 不同代謝型血小板聚集率比較 檢出CYP2C19基因型為慢代謝型7例(9.7%)，中間代謝基因型39例(54.2%)，快代謝型26例(36.1%)；3組的血小板聚集抑制率分別為(67.5±21．6)%、(57．6±23．4)%和(31.4±15.1)%，慢代謝型>中間代謝型>快代謝型(F=35.23，P<0.01)。

2.3 多因素分析 以CR為因變量，以可能危險因素為自變量進(jìn)行多元Logisticc回歸分析，結(jié)果顯示，CYP2C19慢代謝型(*2/*2、*2/*3)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平是發(fā)生CR的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 氯吡格雷抵抗的多因素logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

3.1 CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性 細(xì)胞色素P450 2C19(CYP2C19)是氯吡格雷氧化代謝作用的關(guān)鍵酶，人群中CYP2C19基因的多種不連續(xù)突變等位基因，稱之為基因多態(tài)性。目前已知的CYP2C19等位基因有36個，其中野生型是CYP2C19*1/*1(快代謝)，其編碼有完全活性的酶；最常見的突變位點(diǎn)是核苷酸序列變異為CYP2C19 681G>A的CYP2C19*2，約占所有變異的95%，該位點(diǎn)變異約占東亞人種的55%[8]； CYP2C19*3也是常見的變異等位基因，約見于7%的東亞人，核苷酸序列為CYP2C19 636 G>A。Liu等[9]針對PCI術(shù)后患者的研究發(fā)現(xiàn)攜帶至少1個變異型CYP2C19*2/*3等位基因的患者，1年內(nèi)支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險是純合野生型的3.65倍 (95% CI 1.07～12.38，P=0.038)。國內(nèi)楊莉萍等[10]的系統(tǒng)評價發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2/*3基因攜帶者發(fā)生支架內(nèi)血栓的風(fēng)險顯著增加(P<0.01),與CYP2C19*1基因攜帶者相比，相對危險度增加了92%(P<0.01)。目前多數(shù)研究支持CYP2C19突變基因攜帶與CR的發(fā)生密切相關(guān)。

3.2 CYP2C19基因多態(tài)性分布 張愛玲等[3]對亞洲人群CYP2C19基因突變率的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，中國人群中CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3和*3/*3基因型發(fā)生率分別為37.2%、41.4%、6.7%、9.9%、4.1%和0.7%；本課題組發(fā)現(xiàn)西安地區(qū)漢族人上述各基因型突變發(fā)生率分別為36.1%、43.1%、11.1%、6.9%、2.8%、0%?？傮w基因頻率與國內(nèi)外報道一致，我們的研究中無*3/*3純合子突變個體，可能與本組相對樣本量偏小有關(guān)。因此，CYP2C19*2是漢族人群中CYP2C19基因突變的最常見類型。

3.3 CR相關(guān)危險因素 目前國內(nèi)外研究均證實，CYP2C19基因突變與CR關(guān)系密切[11]，大多數(shù)研究集中在PCI后支架內(nèi)血栓形成。Jia等[12]的研究顯示CYP2C19基因多態(tài)性和氯吡格雷治療急性缺血性卒中發(fā)生CR獨(dú)立相關(guān)；本課題組亦通過多因素回歸分析證實CYP2C19慢代謝基因型突變(*2/*2、*2/*3)是導(dǎo)致CR的獨(dú)立危險因素(OR=7.802，95%CI 1.412～40.304,P=0.018)，與上述報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)卒中人群發(fā)生CR的比率為37.5%，高于國內(nèi)福建地區(qū)陳枝庭等[13]26.5%的報道，但低于北京地區(qū)趙清等[14]報道的58.8%的CR發(fā)生率，提示CR的發(fā)生除了受到CYP2C19基因多態(tài)性的影響之外可能受到藥物相互作用，血脂、基線血糖、吸煙史、卒中史等其他因素的影響[15]。因此，尋找CR發(fā)生的其他潛在危險因素對減少其發(fā)生有重要臨床價值。本研究發(fā)現(xiàn)LDL-C 與CR存在獨(dú)立相關(guān)性，提示嚴(yán)格控制低密度脂蛋白對減少CR具有重要意義。

3.4 藥物治療 由于CYP2C19基因多態(tài)性與CR之間存在密切的相關(guān)性，Panattoni等[16]的研究指出，增加氯吡格雷劑量可提高缺陷性CYP2C19變異基因攜帶者的抗血小板聚集效果,從而減少CR的發(fā)生。Rossi等[17]的研究顯示基于CYP2C19基因篩查調(diào)整劑量的氯吡格雷治療減少了CR的發(fā)生。但目前的研究樣本量過小，需要大樣本研究的進(jìn)一步證實。

綜上所述，目前研究業(yè)已明確CYP2C19*2 基因位點(diǎn)突變與CR關(guān)系最為密切，我們的研究亦證實漢族人群CYP2C19基因突變以*2位點(diǎn)最為常見，并與CR的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LDL-C 水平與氯吡格雷抵抗存在獨(dú)立相關(guān)性，提示降低低密度脂蛋白對減少氯吡格雷抵抗，減少卒中復(fù)發(fā)至關(guān)重要。

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Multivariate analysis of the correlation between the gene ploymorphisms of CYP2C19 and clopidogrel’s resistance in Han nationality acute ischemic stroke patients

LIUZhiqin*,RENJingjing,ZHANGWeiping,DUJingjing,JIAXiaotao,WANGXinlai.*DepartmentofNeurology,Xi’anCentralHospital,Xi’anJiaotongUniversity,ShanxiProvince,Xi’an710003,China

Correspondingauthor:ZHANGWeiping,E-mail:909990451@qq.com

Objective To analyze the relationship between CYP2C19 gene polymorphism and clopidogrel resistance in acute ischemic stroke patients.Methods From July 2012 to September 2014, 72 consecutive patients with acute ischemic stroke (75 mg/d, continuous >7 d) who were hospitalized and treated with clopidogrel. According to the inhibition rate of platelet aggregation induced by ADP, they were divided into clopidogrel resistance (CR) group (27 cases) and non-resistant (NCR) group (45 cases). Gene chip method was used to detect the CYP2C19 genotype of the subjects. According to the type of mutations, the gene chip was divided into fast metabolic type (*1/*1), intermediate metabolism (*1/*2, *1/*3) and slow metabolism (*2/*2,*2/*3, *3/*3). The risk factors associated with the occurrence of clopidogrel resistance were analyzed by multiple Logistic regression analysis.Results The CYP2C19 genotype distribution were statistically significant different between the two groups (χ2=32.302,P<0.05); detected CYP2C19 genotypes were slow metabolism in 7 cases (9.7%), intermediate metabolic genotype 39 cases (54.2%), fast metabolism type in 26 cases (36.1%), 3 groups of platelet aggregation inhibition rate respectively were (67.5±21.6)%, (57.6±23.4)% and (31.4±15.1)%, slow metabolism type > intermediate metabolizers > metabotropic (P<0.01). Multivariate logistic regression analysis showed that CYP2C19 slow metabolizers (* 2 / * 2, *2/*3) (OR=7.802, 95% CI 1.412 to 40.304,P=0.018) and low density lipid protein levels >2.6 mmol / L (OR=3.923, 95% CI 1.314 to 17.927,P=0.032) was independent risk factors for clopidogrel resistance.Conclusion In patients with acute ischemic stroke, CYP2C19 (*2/*2, *2/*3) and low density lipoprotein levels were the independent risk factors for clopidogrel resistance.

CYP2C19 gene polymorphism; Clopidogrel; Resistance; Multivariate analysis

陜西省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃資助項目(No.2014K11-02-03)

710003 西安交通大學(xué)附屬西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉志勤、張衛(wèi)萍、杜晶晶、賈曉濤、王新來);西安市血液病 研究所(任婧婧)

張衛(wèi)萍，E-mail:909990451@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.007

2015-06-08)